Protein-protein interaction: static and dynamics of the association between membrane proteins
Caractérisation de complexes protéiques : etude statique et dynamique d'association entre des proétines membranaires
Résumé
Membrane proteins play a major role in numerous biological processes. However few techniques are developed to study association between membrane proteins. We design a tunable system of model membranes (a L3 phase) in which proteins are incorporated. We monitor the distance between bilayers and the hydrophobic length of the membrane. We focus on diffusion coefficient measurement of membrane proteins to discuss a well-known model of diffusion proposed by Saffman and Delbrück. These results prove that the mobility is highly sensitive to any change in radius of the diffusing object. Thanks to FRAPP technique, we manage to detect and characterize interactions between membrane proteins by studying two different types of binding: the well-known interaction between a biotinated peptide and a streptavidin and the one between two proteins constituting an efflux pump of a Gram-negative bacteria. We answer in the same environment several types of questions: the configuration of the complex, the stoichiometry of the different partners, the dynamics constants such as the association and dissociation rate. Furthermore we are interested in measuring the affinity of the binding. The variations of the binding affinity with temperature are also measured to tackle the problem of energy determination.
Les protéines membranaires interviennent dans de nombreux mécanismes cellulaires. Cependant, peu de techniques sont adaptées à l'étude des interactions entre ces protéines. Nous sommes parvenus à les caractériser dans un milieu de membranes modèles dont l'épaisseur et la séparation entre bicouches sont ajustables. L'étude de la diffusion d'objets membranaires a permis de remettre en question l'utilisation du modèle de Saffman-Delbrück. Ces résultats montrent la sensibilité de la mobilité par rapport à l'état de liaison d'une protéine. Grâce à des mesures de recouvrement de fluorescence, nous avons caractérisé des interactions entre protéines membranaires en étudiant deux exemples : l'interaction connue entre streptavidine et biotine et celle entre des protéines constituant une pompe à efflux chez la bactérie P. aeruginosa. Cette thèse s'articule autour des différentes questions soulevées par une interaction : la géométrie du complexe, sa stoechiométrie selon différentes conditions de pH mais aussi la mesure des constantes dynamiques de l'accrochage comme les taux d'association ou de dissociation ainsi que des constantes d'affinité. Ces mesures ont été effectuées entre des protéines diffusant sur une surface dans des conditions proches de leur environnement biologique.