Molecular mechanisms of alternative splicing regulation and deregulation of Tau and cTNT in Myotonic Dystrophy of Type 1
Mécanismes moléculaires de la régulation et de la dérégulation de l'épissage alternatif de Tau et cTNT dans la Dystrophie Myotonique de Type 1
Résumé
Myotonic Dystrophy of Type 1 (DM1) is an autosomal dominant genetic disease. It is due to a pathological expansion of CTG triplets in the 3'UTR region of the DMPK gene. Affected individuals suffer from a multi-systemic pathogenesis, molecularly characterized by alternative splicing deregulations of several transcripts favoring the expression of fetal isoforms. The major physiopathological hypothesis for DM1 is based on a toxic RNA gain of function of the mutated mRNAs that lead to alterations of splice regulating factors of the Mbnl and CELF families. In the brains of DM1 affected individuals, Tau alternative splicing deregulation leads to the overexpression of the fetal isoform and notably to the exclusion of exons 2 and 3. This splicing deregulation is accompanied by the aggregation of the protein as a sign of neurodegeneration. Therefore, the first aim of this work was to understand the molecular mechanisms responsible of the pathological splicing phenotype of Tau in DM1. We also took an interest for the cardiac Troponin T transcript (cTNT), expressed in the heart and subjected to a splicing deregulation in DM1 that also leads to a fetal splicing profile. Our results regarding Tau show the fetal splicing profile, and particularly exon 2 and 3 exclusion, is a phenotype that can be obtained by different molecular pathways implicating different cis splice regulating elements. In DM1, this phenotype results from a specific mechanism. In the case of exon 2, this mechanism implicates an intronic "silencer" located in a region relatively far downstream of the exon. This region seems to be also the one responsible for the effect of the splicing factor ETR-3, belonging to the CELF family and capable of promoting exon 2 and 3 exclusion. When it comes to splicing regulation of cTNT exon 5, it involves several cis regulating elements, all located in the 150 intronique nucleotides surrounding the exon. Among these elements, we identify one "silencer" and one "enhancer" upstream of the exon and two enhancers downstream. Our results show that the intronic region upstream is necessary for the CTG expansion effect. Moreover, we identify in this region several novel functional binding sites for the splicing factor Mbnl1 that are here reported for the first time. In conclusion, our work reveals several cis regulating elements of Tau and cTNT. For these transcripts, the intronic regions implicated in the effect of the CTG expansion are also the ones mediating the effects of splicing factors Mbnl and CELF. Our results reinforce the physiopathological hypothesis for mechanisms of alternative splicing deregulations in DM1. They also show the specificity of the mechanisms implicated in the pathology, therefore providing therapeutic targets for DM1.
La Dystrophie Myotonique de type I (DM1) est une maladie génétique à transmission autosomique dominante. Elle est due à une expansion pathologique de triplets CTG au sein de la région 3'UTR du gène DMPK. Les individus atteints de DM1 souffrent d'une atteinte multi-systémique, qui se caractérise, sur le plan moléculaire, par une altération de l'épissage alternatif de plusieurs transcrits privilégiant l'expression d'isoformes foetales. L'hypothèse physiopathologique majeure de la DM1 repose sur un gain de fonction toxique des ARNm mutés conduisant à des altérations de facteurs régulateurs d'épissage des familles Mbnl et CELF. Dans le cerveau de patients atteints de DM1, un défaut d'épissage alternatif du transcrit de Tau conduit à la surexpression de l'isoforme foetale avec, notamment, une exclusion préférentielle des exons 2 et 3. Ce défaut s'accompagne d'une agrégation de la protéine, signe d'une dégénérescence neuronale. Ainsi, le premier objectif de ce travail a été de mieux connaître les mécanismes moléculaires responsables du phénotype d'épissage pathologique de Tau dans la DM1. Nous nous sommes également intéressés au transcrit de la Troponine T cardiaque (cTNT), transcrit exprimé dans le coeur et dont l'altération d'épissage avec la DM1 conduit à un profil d'épissage de type foetal. Concernant Tau, nos résultats montrent que le profil d'épissage foetal., et en particulier, l'exclusion des exons 2 et 3, est un phénotype qui peut être obtenu par différentes voies moléculaires impliquant différents éléments cis régulateurs. Dans la DM1, ce phénotype résulte d'un mécanisme bien spécifique. Pour l'exon 2, celui-ci semble impliquer un « silencer » intronique situé dans une région relativement loin en aval de l'exon. Cette même région semble également médier l'effet du facteur d'épissage ETR-3, facteur appartenant à la famille CELF et qui favorise l'exclusion des exons 2 et 3. Pour ce qui est de la régulation de l'exon 5 de cTNT, celle-ci met en cause plusieurs éléments cis régulateurs, tous localisés dans les 150 nucléotides introniques encadrant l'exon. Parmi ces éléments, on identifie un « silencer » et un « enhancer » en amont de l'exon et deux « enhancers » en aval. Nos résultats montrent qu'une région intronique en amont est indispensable à l'effet des expansions de CTG. De plus, dans cette région, nous avons identifié de nouveaux sites fonctionnels de fixation du facteur d'épissage Mbnl1 par rapport à ceux décrits dans la littérature. En conclusion, nos travaux mettent en évidence plusieurs éléments cis régulateurs d'épissage alternatif de Tau et cTNT. Pour ces transcrits, les régions introniques en jeu dans l'effet des expansions de triplets CTG le sont également dans l'effet des facteurs Mbnl ou CELF. Ces résultats confortent l'hypothèse physiopathologique des mécanismes de dérégulation de l'épissage alternatif dans la DM1. Ils montrent également la spécificité des mécanismes mis en jeu dans la pathologie, fournissant ainsi des cibles thérapeutiques