Rôle des microdomaines membranaires dans le ciblage apical de la nucléotide pyrophosphatase NPP3 dans les cellules MDCK - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2007

Role of the membrane microdomains in the apical targeting of the nucleotide pyrophosphatase NPP3 in MDCK cells

Rôle des microdomaines membranaires dans le ciblage apical de la nucléotide pyrophosphatase NPP3 dans les cellules MDCK

Résumé

Summary The plasmic membrane of the polarized epithelial cells comprises two distinct domains, the apical domain and the basolateral domain. Each domain has a determined composition in lipids and proteins, enabling them to ensure of the specific functions. The molecular mechanisms responsible for the sorting and the targeting of transmembrane proteins towards the apical pole are still badly known. The apical membrane is enriched in glycosphingolipides and cholesterol which form microdomains called “rafts”. In experiments, the rafts can be isolated in the form of DRM (detergent-resistant membranes) defined by their resistance to a nonionic detergent, the Triton X-100. It was proposed that the rafts recruit apical proteins on the level of the trans-golgien network and are used as platform for their targeting with the apical pole. Indeed the proteins anchored by the glycosylphosphatidyl-inositol are resistant to the Triton and are in general localised with the apical membrane. On the other hand, the majority of apical transmembrane proteins are soluble in the Triton, although they are resistant to the action of mild detergents like Lubrol WX. The objective of work of thesis was to study the role of the rafts in the apical transmembrane protein targeting and to include/understand the differential effect of the Triton and Lubrol on their solubilization. The nucleotides pyrophosphatases NPP1 (basolateral) and NPP3 (apical) expressed in a stable way in cells MDCK were used as models. NPP3 is insoluble in Lubrol and partially insoluble in the Triton, while NPP1 is primarily solubilized. The study of the localization and the sensitivity to the detergents of mutants and chimeraes a combining of the cytoplasmic, transmembrane and extracellular domains of NPP3 and NPP1, showed that there was not strict correlation between apical targeting and resistance to the detergents. The resistance of NPP3 to solubilization by Lubrol is acquired precociously during its biosynthesis, independently of its final destination. This resistance depends on amino acids charged positively located in the cytoplasmic tail, close to the membrane. In order to include/understand the selectivity of the Triton and Lubrol in the extraction of proteins and the membrane lipids, the lipidic composition of the DRM obtained after extraction by the Triton and Lubrol were compared. The DRM extracted by the Triton and Lubrol are cholesterol enriched what corresponds to the definition of the rafts. However, the DRM Triton are impoverished in lipids of the internal layer while the DRM Lubrol are enriched in phosphatidylethanolamine. The DRM Lubrol are also enriched in protein associated with the internal layer with the membrane. In conclusion, this work shows that the resistance of apical protein NPP3 to the extraction by Lubrol, and partly by the Triton, is an intrinsic property which probably corresponds to an adaptation of protein to the lipidic composition of the apical domain, but that this property does not determine its polarized targeting. Moreover, this work shows that the detergents are very interesting tools to study the interactions between the membrane proteins and lipids, but that there probably does not exist detergent able to insulate in a strict way of the membrane microdomains such as are defined the rafts. Our results suggest that the layer interns rafts is enriched in phosphatidylethanolamine and cholesterol, that it is partly solubilized by the Triton, which would destabilize transmembrane proteins and would involve their extraction. Keywords : detergent, raft,, apical targeting, cholesterol, membrane microdomain, inner membrane leaflet, phosphatidylethanolamine.
La membrane plasmique des cellules épithéliales polarisées comporte deux domaines distincts, le domaine apical et le domaine basolatéral. Chaque domaine a une composition en lipides et en protéines déterminée, leur permettant d'assurer des fonctions spécifiques. Les mécanismes moléculaires responsables du tri et de l'adressage des protéines transmembranaires vers le pôle apical sont encore mal connus. La membrane apicale est enrichie en glycosphingolipides et en cholestérol qui forment des microdomaines appelés « rafts ». Expérimentalement, les rafts peuvent être isolés sous forme de DRM (detergent-resistant membranes) définis par leur résistance à un détergent non ionique, le Triton X-100. Il a été proposé que les rafts recrutent les protéines apicales au niveau du réseau trans-golgien et servent de plateforme pour leur adressage au pôle apical. Effectivement les protéines ancrées par le glycosylphosphatidyl-inositol sont résistantes au Triton et sont localisées en général à la membrane apicale. En revanche, la plupart des protéines transmembranaires apicales sont solubles dans le Triton, bien qu'elles soient résistantes à l'action de détergents plus doux comme le Lubrol WX. L'objectif des travaux de thèse a été d'étudier le rôle des rafts dans l'adressage apical de protéines transmembranaires et de comprendre l'effet différentiel du Triton et du Lubrol sur leur solubilisation. Les nucléotides pyrophosphatases NPP1 (basolatérale) et NPP3 (apicale) exprimées de façon stable dans les cellules MDCK ont servi de modèles. NPP3 est insoluble dans le Lubrol et partiellement insoluble dans le Triton, tandis que NPP1 est essentiellement solubilisée. L'étude de la localisation et de la sensibilité aux détergents de mutants et de chimères combinant des domaines cytoplasmiques, transmembranaires et extracellulaires de NPP3 et NPP1, a montré qu'il n'existait pas de corrélation stricte entre l'adressage apical et la résistance aux détergents. La résistance de NPP3 à la solubilisation par le Lubrol est acquise précocement au cours de sa biosynthèse, indépendamment de sa destination finale. Cette résistance dépend d'acides aminés chargés positivement situés dans la queue cytoplasmique, proches de la membrane. Afin de comprendre la sélectivité du Triton et du Lubrol dans l'extraction des protéines et des lipides membranaires, la composition lipidique des DRM obtenus après extraction par le Triton et le Lubrol a été comparée. Les DRM extraits par le Triton et le Lubrol sont enrichis en cholestérol ce qui correspond à la définition des rafts. Cependant, les DRM Triton sont appauvris en lipides du feuillet interne tandis que les DRM Lubrol sont enrichis en phosphatidyléthanolamine. Les DRM Lubrol sont également enrichis en protéines associées au feuillet interne de la membrane. En conclusion, ces travaux montrent que la résistance de la protéine apicale NPP3 à l'extraction par le Lubrol, et en partie par le Triton, est une propriété intrinsèque qui correspond probablement à une adaptation de la protéine à la composition lipidique du domaine apical, mais que cette propriété ne détermine pas son adressage polarisé. De plus, ces travaux montrent que les détergents sont des outils très intéressants pour étudier les interactions entre les protéines et les lipides membranaires, mais qu'il n'existe probablement pas de détergent capable d'isoler de façon stricte des microdomaines membranaires tels que sont définis les rafts. Nos résultats suggèrent que le feuillet interne des rafts est enrichi en phosphatidyléthanolamine et en cholestérol, qu'il est en partie solubilisé par le Triton, ce qui déstabiliserait les protéines transmembranaires et entraînerait leur extraction. Mots clés: détergent, raft, , ciblage apical, cholestérol, microdomaine membranaire, feuillet interne de la membrane, phosphatidyléthanolamine.
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Dates et versions

tel-00429983 , version 1 (05-11-2009)

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  • HAL Id : tel-00429983 , version 1

Citer

Jean-Louis Delaunay. Rôle des microdomaines membranaires dans le ciblage apical de la nucléotide pyrophosphatase NPP3 dans les cellules MDCK. Biologie cellulaire. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2007. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00429983⟩
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