Etude par génétique inverse du gène codant la protéine TARGET OF RAPAMYCIN d'Arabidopsis thaliana (AtTOR), l'homologue d'une kinase contrôlant la croissance cellulaire chez les eucaryotes
Résumé
TOR (target of rapamycin) protein kinases were identified in yeast, mammals and Drosophila as central controllers of cell growth. Thu, G1 to S phases progression through the cell cycle is blocked by rapamycin, a drug which specifically inhibits TOR activity by forming a ternary complex with the peptidyl-prolyl isomerase FKBP12 (FK506 and rapamycin binding protein), and the FKBP-rapamycin binding domain (FRB) of TOR proteins. This work presents the study, the Arabidopsis homologue of yeast and animals TOR genes. By using RT-PCR and 5'-RACE, we cloned the cDNA of the single Arabidopis TOR (AtTOR) gene which contains 55 introns and encodes a protein of 300 kDA showing a high level of identity with its homologues from yeast and animals. However, the vegetative growth of Arabidopsis and other plants tested is insensitive to rapamycin. Nonetheless, we have shown, using a two hybrid system, that the AtTOR FRB domain is able to bind yeast FKBP12 in the presence of rapamycin. The function of AtTOR has been studied by reverse genetics. Two mutants, tor-1 and tor-2, have been identified in the INRA T-DNA insertion library (Versailles, France). In both mutants, the T-DNA is inserted upstream of the FRB and kinase domains of AtTOR. The two mutants do not complement each other and have an embryo-lethal phenotype in which one quarter of the seeds from a selfed pollinization of a heterozygotic parent die because of arrested development of the embryo and endosperm. We used a translational fusion of AtTOR with the GUS reporter gene in the tor-1 mutant to show that AtTOR expression is restricted to the developing endosperm and embryo, and all the primary meristems of the plant. This is different to mammalian and Drosophila TORs, which are expressed in all tissues. Theses results allow us to discuss the role of AtTOR in cell growth and proliferation Furthermore, experiments attempting to render Arabidopis sensitive to rapamycin, by transformation with yeast FKBP12, were undertaken and constructs for AtTOR overexpression using the GAL4 system were made.
Les protéines kinase TOR (Target Of Rapamycin) ont été identifiées, chez les levures, les mammifères et la drosophile, comme des régulateurs majeurs de la croissance cellulaire. Ainsi, la progression des phases G1 à S du cycle cellulaire est bloquée par la rapamycine, un antibiotique capable d'inhiber spécifiquement TOR en formant un complexe ternaire avec le domaine FRB (FKBP-rapamycin binding domain) of TOR et une autre protéine appelée FKBP12 (FK506 and rapamycin Binding Protein). Ce travail présente l'étude moléculaire et génétique de l'homologue d'Arabidopsis thaliana des gènes TOR de levures et d'animaux. Nous avons clone l'ADNc de l'unique gène TOR d'Arabidopsis (AtTOR) qui contient 55 introns et code une protéine de 300 kDa qui présente un important taux d'identité avec ses homologues d'animaux et de levure. Cependant, la croissance végétative d'Arabidopsis, ainsi que celle d'autres plantes testées, sont insensibles à la rapamycine. Néanmoins, des expériences de double hybride ont montré que le domaine FRB de AtTOR est capable de fixer FKBP12 de levure d'une manière dépendante de la rapamycine. Deux mutants ( tor-1 et tor-2) ont été identifiés dans la collection de mutants d'insertion d'un ADN-T de l'INRA de Versailles. Chez les deux mutants, l'ADN-T s'est inséré en amont des domaines FRB et kinase. Les deux mutants ne se complémentent pas et ont un phénotype embryon létal caractérisé par le fait qu'un quart des graines d'une silique hétérozygotes présentent un arrêt prématuré du développement de l'albumen et de l'embryon, ce dernier étant bloqué au stade globulaire. Nous avons utilisé une fusion traductionnelle entre AtTOR et le gène rapporteur GUS présente dans le mutant tor-1 pour montrer que l'expression de AtTOR est restreinte à l'embryon, l'albumen, et tous les méristèmes primaires. Cela est différent de TOR de mammifères et TOR de drosophile qui sont exprimés dans tous les tissus. Ces résultats nous ont amené à discuter le rôle de AtTOR dans la croissance cellulaire et la prolifération. De plus, des expériences ayant pour but de rendre Arabidopsis résistante à la rapamycine ont été initiées, et des constructions ont été réalisées pour sur-exprimer AtTOR avec le système GAL4.