Le secretome, un modèle adapté à l'étude des protéines sécrétées par les tumeurs.<br />Application à l'analyse du rôle joué par p53 sur la sécrétion de protéines par des cellules du cancer du poumon.

Jérôme Chenau

Abstract : Cancer is a real public health problem and will represent in 2010 the first cause of mortality. So the knowledge of this disease and its mechanisms remains a great challenge. Malignant processes such as metastasis, invasion, or angiogenesis are tightly dependent on the composition of the extracellular medium, which is itself affected by the release of proteins by the tumor cells. The mutation of pro- and anti-oncogenic factors plays an important role in tumor progression. In this work, we want to ask the following major question: is it interesting to study by proteomics the secreted proteins by tumor to better understand tumorigenesis mechanisms and is it useful for clinical biomarker discovery? We focused on lung cancer which is the cancer with the greater mortality and incidency frequences in the world. This cancer has the greater p53 mutation rates. This protein is a major tumor suppressor known to modulate the release of proteins by the tumor cells; however, while p53-modulated intracellular proteins have been extensively studied, little is known concerning their extracellular counterparts. Here, we developed a proteomics process using iTRAQ labeling, OFFGEL isoelectric focusing and LC-MALDI-MS/MS analysis efficient to the study of this class of proteins. We used it to characterize the p53-dependent secretome of a lung tumor model in vitro. We identified 909 proteins released by these cells, among which 91 are p53-modulated. This differential secretome analysis promises more detailed of how the loss of wt-p53 contributes to tumorigenic processes through the modulation of secreted proteins. We also demonstrated that the modulation of exported proteins can be detected in vivo in total protein extracts and plasma of tumor-bearing mice. This is the first report establishing that the in vitro cell line secretome is reliable and reflects the extracellular release of proteins from tumor cells in vivo and could be used to identify putative tumor markers.

Résumé : Le cancer est un véritable problème de santé publique et représentera en 2010 la première cause de mortalité dans le monde. La lutte contre cette maladie est donc, plus que jamais, un enjeu capital. Les processus tumoraux associés à la carcinogénèse, tels que la métastase, l'invasion ou l'angiogenèse, dépendent étroitement de la composition du milieu extracellulaire, lui-même affecté par la sécrétion de protéines par les cellules tumorales. La mutation ou la variation d'expression de facteurs pro- ou anti-oncogénique joue un rôle important dans le développement et la progression de la tumeur. Durant ce travail de thèse, nous avons voulu apporter des éléments de réponse à la problématique suivante : l'étude par protéomique des protéines sécrétées par la tumeur apporte t'elle des informations contribuant à la compréhension des mécanismes de la tumorogenèse et peut elle permettre de mettre en valeur de nouvelles cibles d'intérêt clinique ? Nous avons ciblé notre étude sur le cancer du poumon, le plus fréquent au niveau mondial tant en terme d'incidence que de mortalité. Ce cancer présente le plus fort taux de mutation du gène p53, un anti-oncogène clé de la cellule. Cette perte de fonction module la sécrétion de nombreuses protéines dont l'investigation est primordiale, bien que paradoxalement, peu étudiée. Notre travail s'est ainsi focalisé sur l'étude de l'influence de p53 sur la modulation de la sécrétion de protéines par les tumeurs du poumon. Nous avons ainsi développé un procédé d'analyse protéomique adapté, basé notamment sur un marquage iTRAQ, une séparation par isoélectrofocalisation de type OFFGEL et une analyse LC-MALDI-MS/MS. Ce procédé a été appliqué à l'étude du rôle joué par l'expression conditionnelle de p53 sur la modulation du secretome d'une lignée cellulaire d'adénocarcinome du cancer du poumon non à petites cellules. Plusieurs protéines d'intérêt ont ainsi été caractérisées et confirmées in vivo chez la souris au niveau tumoral et plasmatique. Ces résultats apportent une meilleure compréhension du rôle primordial joué par l'altération de p53 dans la modulation de l'environnement tumoral et font des secretomes cellulaires un modèle de choix pour l'identification de marqueurs tumoraux.

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