Sensing the activity of chromatin remodelling factors, at the single molecule level.
Etude du mécanisme d'action des facteurs de remodelage de la chromatine, à l'échelle de la molécule unique.
Résumé
A general feature of eukaryotes is that their genomic DNA associates with proteins (essentially histone octamers) to form chromatin. In addition to providing a means of packaging DNA within nuclei, chromatin provides an additional level at which gene expression can be regulated. In order to be able to regulate gene expression at this level, eukaryotes have devised a number of strategies by which they can modulate chromatin structure. One of them implies the action of large complexes, called chromatin remodelling factors, which use the energy of ATP hydrolysis to move histone octamers relative to DNA in order to make the DNA accessible. The mechanisms for histone octamers mobilization are still under question.
Here, we have studied the action of three different chromatin remodelling factors (RSC, yISW1a and CHD1), using a magnetic tweezers setup. We first sensed their action on a bare DNA substrate : we showed that they all have a distinct behaviour in the presence of bare DNA, suggesting a different mechanism in the recognition of this substrate and presumably in their further remodelling activity. As chromatin -and not bare DNA- is their natural substrate, we developed a protocol to prepare, in a reproducible way, a mononucleosomal substrate -the simplest nucleosomal substrate that we can think of- that can be manipulated with magnetic tweezers. While pulling on it, we found a clear signature that differs from a bare DNA substrate. This guaranties us the presence of one nucleosome positioned on a DNA substrate, which is a prerequisite for further investigations of the activity of chromatin remodelling factors on chromatin.
Here, we have studied the action of three different chromatin remodelling factors (RSC, yISW1a and CHD1), using a magnetic tweezers setup. We first sensed their action on a bare DNA substrate : we showed that they all have a distinct behaviour in the presence of bare DNA, suggesting a different mechanism in the recognition of this substrate and presumably in their further remodelling activity. As chromatin -and not bare DNA- is their natural substrate, we developed a protocol to prepare, in a reproducible way, a mononucleosomal substrate -the simplest nucleosomal substrate that we can think of- that can be manipulated with magnetic tweezers. While pulling on it, we found a clear signature that differs from a bare DNA substrate. This guaranties us the presence of one nucleosome positioned on a DNA substrate, which is a prerequisite for further investigations of the activity of chromatin remodelling factors on chromatin.
Chez les eucaryotes, l'ADN s'associe à des octamères d'histones pour former une structure nucléoprotéique dense appelée chromatine. Sous cette forme compacte, la chromatine agit comme une barrière topologique empêchant des facteurs de transcription par exemple, d'interagir avec l'ADN. Il va donc être essentiel de moduler la structure de la chromatine pour réguler l'accès à l'ADN et donc l'expression des gènes. L'une des stratégies adoptées, implique l'intervention de complexes multi-protéiques, appelés facteurs de remodelage de la chromatine, qui utilisent l'énergie issue de l'hydrolyse de l'ATP pour perturber le positionnement des octamères d'histones par rapport à l'ADN. Les mécanismes sous-jacents, éventuellement variés, sont encore méconnus.
Nous utilisons ici un dispositif de pinces magnétiques pour sonder l'action de différents facteurs de remodelage (RSC, yISW1a et CHD1) sur une molécule d'ADN nue. Nous montrons que ces complexes ont des comportements différents vis-à-vis de ce substrat : en l'absence d'ATP, yISW1a et CHD1 s'accrochent à l'ADN de manière coopérative et réduisent son extension bout-à-bout. En présence d'ATP, RSC est capable de former de larges boucles d'ADN, sous-enroulées, dont la taille dépend de la force et de la concentration en ATP. Nous souhaitons maintenant sonder l'action de ces facteurs sur un substrat nucléosomal. Dans ce but, nous avons mis au point un protocole efficace pour préparer un substrat mono-nucléosomal, manipulable en pinces magnétiques, et nous avons défini une procédure pour s'assurer de la présence du nucléosome. Ce substrat de choix va nous servir de base pour l'étude de l'action des facteurs de remodelage de la chromatine.
Nous utilisons ici un dispositif de pinces magnétiques pour sonder l'action de différents facteurs de remodelage (RSC, yISW1a et CHD1) sur une molécule d'ADN nue. Nous montrons que ces complexes ont des comportements différents vis-à-vis de ce substrat : en l'absence d'ATP, yISW1a et CHD1 s'accrochent à l'ADN de manière coopérative et réduisent son extension bout-à-bout. En présence d'ATP, RSC est capable de former de larges boucles d'ADN, sous-enroulées, dont la taille dépend de la force et de la concentration en ATP. Nous souhaitons maintenant sonder l'action de ces facteurs sur un substrat nucléosomal. Dans ce but, nous avons mis au point un protocole efficace pour préparer un substrat mono-nucléosomal, manipulable en pinces magnétiques, et nous avons défini une procédure pour s'assurer de la présence du nucléosome. Ce substrat de choix va nous servir de base pour l'étude de l'action des facteurs de remodelage de la chromatine.