Enantioselective DNA and RNA aptamers : chiral separation applications in micro-chromatography and capillary electrophoresis (CE).
Aptamères énantiosélectifs en série ADN et ARN : applications à la séparation chirale en micro-chromatographie et en électrophorèse capillaire (EC).
Résumé
The separation of enantiomers is of a great interest in the pharmaceutical, chemical and food fields. Aptamers have been used by the Department of Molecular Pharmacochemistry (DPM) as new target-specific chiral selectors. These oligonucleotides, RNA or DNA, selected by SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), have the ability to bind their target molecules with an affinity equal (or superior) to that retrieved with the antibodies. The aim of this work is to study the enantioselective properties of RNA and DNA aptamers by micro-HPLC and CE. A chiral stationary phase L-RNA aptamer anti-D-histidine was designed using an immobilization strategy based on the biotin-streptavidin link. A novel covalent strategy for the immobilization of the aptamers was developed to enlarge the conditions of use and to improve the stability of these aptamers columns. The use of these new chiral selectors was then spread in an analysis by CE. The first study was accomplished using an L-RNA aptamer anti-D-arginine characterized by a very weak constant of dissociation (Kd = 330 nM) and a very high enantioselectivity (α = 12000). This study allowed to appreciate the special characteristics of this aptamer and to extend its use in an enantioselective competitive assay. An enantiomeric impurity as low as 0,01% was achieved. A similar assay, where a direct contact between the aptamer and its enantiomer target is favoured, allowed to increase the method sensitivity and could allow to reduce the detection limit thanks to the use of a fluorescence detection.
La séparation d'énantiomères est d'un grand intérêt pour les industries pharmaceutiques, chimiques et agroalimentaires. Les aptamères sont utilisés au sein du Département de Pharmacochimie Moléculaire (DPM) en tant que nouveaux sélecteurs chiraux spécifiques d'une cible prédéterminée. Il s'agit d'oligonucléotides, en série ADN et ARN, générés par la procédure SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), ayant la capacité à fixer leurs molécules cibles avec une affinité égale voir supérieure à celle des anticorps. Ce travail a pour objectif d'étudier les propriétés énantiosélectives des aptamères, en série ADN et ARN, par micro-CLHP et EC. Une phase stationnaire chirale aptamère L-ARN anti-D-histidine a été créée en utilisant une stratégie d'immobilisation biotine-streptavidine dans le but d'étudier les propriétés énantiosélectives de cet oligonucléotide récemment isolé. Une nouvelle stratégie d'immobilisation covalente de l'aptamère a été développée afin d'élargir les conditions d'utilisation et d'améliorer la stabilité de ces colonnes aptamères. L'utilisation de ces nouveaux sélecteurs chiraux a ensuite été étendue à une analyse par EC. La première étude a été réalisée sur un aptamère test L-ARN anti-D-arginine caractérisé par de très fortes affinité (Kd = 330 nM) et énantiosélectivité (α = 12000). Ce travail a permis d'apprécier les caractéristiques exceptionnelles de cet aptamère et d'envisager son utilisation dans un essai énantiosélectif par compétition. Une impureté énantiomérique de 0,01% a ainsi été détectée. Un essai similaire, où un contact direct entre l'aptamère et son énantiomère cible est favorisé, a permis d'augmenter la sensibilité de la méthode et pourrait permettre d'abaisser la limite de détection grâce à l'utilisation d'une détection par fluorescence.