Mise en évidence, par spectroscopies de Résonance Paramagnétique Electronique et d'absorption électronique UV-visible, de la formation de radicaux Tryptophanyles et Tyrosyles par transfert d'électron intramoléculaire vers l'hème dans les catalases monofonctionnelles et peroxydases bifonctionnelles
Résumé
Catalases, peroxidases and catalase-peroxidases (KatGs) regulate the cellular concentration of hydrogen peroxide. We investigated the reactive intermediates of these enzymes by combining multifrequency (9-285 GHz) Electron Paramagnetic Resonance spectroscopy, UVvisible electronic absorption, deuterium labelling and site-directed mutagenesis. We identified tyrosyl and tryptophanyl radicals as alternative reactive intermediates to the [Fe(IV)=O Por•+]. The comparative study of eight catalases allowed us to demonstrate that temperature, pH and oxidant concentration favour the formation of the [Fe(IV)=O Tyr•] species in beef liver, human erythrocytes, B. abortus and M. lysodeikticus catalases. These findings would explain the different specific activities with H2O2 of these enzymes. If considering that the spontaneous electron transfer between tyrosine and the porphyrin would be in competition with the H2O2 disproportionation. KatGs are bifunctional enzymes, which disproportionate the H2O2 as efficiently as monofunctional catalases, due to specific structural features. Our EPR study showed that the reaction mechanism of KatGs is more complex than that of peroxidases and catalases. One tyrosyl and two tryptophanyle radicals were detected in B. pseudomallei KatG. Substrates tests performed with ABTS and isoniazid (front-line pro-drug used in the treatment of tuberculosis) revealed that these protein-based radicals could play the role of cofactors. Comparison of the protein-based intermediates formed by seven KatGs, showed that the tryptophan radical site is unique but not conserved. The localisation and the nature of the protein-based radicals may influence the reactivity of KatGs towards substrates.
Les catalases, les peroxydases et les catalase-peroxydases sont des hémoprotéines, dont l'activité enzymatique essentielle est la régulation de la concentration cellulaire du peroxyde d'hydrogène. Au cours de ce travail de thèse, nous avons mis en évidence et caractérisé, dans ces protéines, des intermédiaires réactionnels issus de l'oxydation de tyrosines et/ou de tryptophanes, alternatifs au composé I, [Fe(IV)=O Por•+]. La prise en compte de la formation de tels radicaux protéiques nous a amené à réexaminer le mécanisme des catalases et des peroxydases, jusque là centré sur l'oxydo-réduction de l'hème. Pour déterminer les structures électroniques et la réactivité des intermédiaires réactionnels, nous avons utilisé une approche multidisciplinaire combinant les spectroscopies de Résonance Paramagnétique Electronique (RPE) multifréquences (9-285 GHz), d'absorption électronique UV-visible par stopped-flow, ainsi que la mutagenèse dirigée et le marquage isotopique. L'étude comparative de huit catalases, provenant de souches bactériennes et de mammifères, nous a permis de démontrer que la température de réaction, le pH et l'excès d'oxydant favorisent la formation de l'intermédiaire [Fe(IV)=O Tyr•], résultant du transfert d'électron intramoléculaire entre la tyrosine et la porphyrine dans les catalases de foie de boeuf, d'érythrocytes humains, de B. abortus et de M. lysodeikticus. Nos études ont montré que l'intermédiaire [Fe(IV)=O Por•+] est prédominant à T ≥ 20°C. Ceci explique pourquoi les études cinétiques de la littérature, pour lesquelles seule l'absorption UV-visible à température ambiante a été utilisée, n'avaient pas permis de mettre en évidence la formation du radical tyrosyle. Nos résultats expliqueraient aussi les différences d'efficacité de dismutation du peroxyde d'hydrogène de ces catalases. En effet, le transfert spontané d'électron entre la tyrosine et la porphyrine, favorisé dans certaines catalases, serait en compétition avec la réaction entre l'intermédiaire [Fe(IV)=O Por•+] et le peroxyde d'hydrogène. Dans le cadre d'études spécifiques sur les catalase-peroxydases (KatGs) et en utilisant la catalase-peroxydase de B. pseudomallei comme cas d'étude, nous avons pu mettre en évidence la formation d'un radical tyrosyle et de deux intermédiaires tryptophanyles, dont l'un est formé sur le Trp330, équivalent au site radicalaire de la cytochrome c peroxydase. Nous avons démontré que l'intermédiaire [Fe(IV)=O Por•+] réagit avec l'ABTS et que le [Fe(IV)=O Trp330 •+] n'est pas l'intermédiaire réactif vis-à-vis de l'isoniazide (antibiotique utilisé dans le traitement de la tuberculose). Notre étude comparative de sept catalaseperoxydases a démontré que le site de formation du radical tryptophanyle est unique pour chaque enzyme, mais peut différer entre deux protéines, ce qui expliquerait en partie leurs différences de réactivité vis-à-vis de l'ABTS et de l'isoniazide. Nous avons montré que dans les catalase-peroxydases, les radicaux protéiques peuvent jouer le rôle de cofacteurs dans l'oxydation des substrats et que le mécanisme de la réaction de dismutation du peroxyde d'hydrogène diffère de celui des catalases monofonctionnelles. Afin de comprendre les propriétés physico-chimiques permettant et favorisant la formation des radicaux protéiques, en tant qu'intermédiaires alternatifs à l'intermédiaire [Fe(IV)=O Por•+], nous avons caractérisé une peroxydase de raifort reconstituée, dans laquelle l'hème à été remplacé par un hème lié par liaison covalente à une tyrosine ou à un tryptophane.
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