IRP (Iron Regulatory Protein) involments in the animals iron metabolism
Implication des protéines IRP (Iron Regulatory Protein) dans le métabolisme du fer chez les animaux
Résumé
Iron Regulatory Protein 1 (IRP1) is a cytosolic protein that regulates the intracellular iron concentration in metazoans by a post-transcriptional mechanism. It binds specific sequences, called Iron responsive Element (IRE), on the untranslated regions of different mRNA involved in iron homeostasis. When iron is abundant, IRP1 looses its RNA-binding activity, assembles a [4Fe-4S] cluster and becomes an aconitase. The building and destruction of the iron-sulfur cluster is a key feature of the regulation.
The recombinant human IRP1 has been purified as the aconitase [4Fe-4S] form and the reaction of various compounds able to modify the IRP1 activity has been studied. Several reactive oxygen species in small excess over the protein produce the inactive [3Fe-4S] form. The cytostatic drug, doxorubicin, changes IRP1 activity, but its impact depends on the conditions and involves several mechanisms. Large amounts of 2-mercaptoethanol fully convert IRP1 into its IRE-binding form. Ethanol plays a similar role, and these chemicals act as solvents in this process.
IRP1 has been investigated by a two hybrid approach in the yeast Saccharomyces cerevisiae. No genuine physiological partners have been discovered. Alternatives approaches may be needed toward this aim.
The possibility of measuring IRE binding to IRP1 by a fluorescent assay coupled to capillary electrophoresis has been probed. Our data do not validate the method but they provide indications about how to improve the sensitivity and efficiency to develop it.
Conformational changes between the two active forms of IRP1 have been analyzed by two complementary methods. The building of some secondary structure elements depends on the form of the protein being studied and on the binding of substrates. The hydrodynamic properties also vary between these different states. Without additional structural information on IRP1, these studies give an idea about how IRP1 fulfils its regulatory function.
The recombinant human IRP1 has been purified as the aconitase [4Fe-4S] form and the reaction of various compounds able to modify the IRP1 activity has been studied. Several reactive oxygen species in small excess over the protein produce the inactive [3Fe-4S] form. The cytostatic drug, doxorubicin, changes IRP1 activity, but its impact depends on the conditions and involves several mechanisms. Large amounts of 2-mercaptoethanol fully convert IRP1 into its IRE-binding form. Ethanol plays a similar role, and these chemicals act as solvents in this process.
IRP1 has been investigated by a two hybrid approach in the yeast Saccharomyces cerevisiae. No genuine physiological partners have been discovered. Alternatives approaches may be needed toward this aim.
The possibility of measuring IRE binding to IRP1 by a fluorescent assay coupled to capillary electrophoresis has been probed. Our data do not validate the method but they provide indications about how to improve the sensitivity and efficiency to develop it.
Conformational changes between the two active forms of IRP1 have been analyzed by two complementary methods. The building of some secondary structure elements depends on the form of the protein being studied and on the binding of substrates. The hydrodynamic properties also vary between these different states. Without additional structural information on IRP1, these studies give an idea about how IRP1 fulfils its regulatory function.
Iron Regulatory Protein 1 (IRP1) est une protéine cytosolique dont le rôle est de réguler la concentration de fer intracellulaire chez les métazoaires par un mécanisme post-transcriptionnel. Elle interagit avec certains ARN messagers au niveau de motifs spécifiques appelés IRE (Iron Responsive Element) situés dans leurs régions non traduites et modifie la synthèse des protéines correspondantes. En présence de fer, IRP1 perd cette capacité de fixation, intègre un agrégat [4Fe-4S] et acquiert une activité aconitase. La régulation s'effectue donc par un processus d'assemblage et de désassemblage du centre fer-soufre.
La réactivité de la protéine recombinante IRP1 humaine, purifiée sous sa forme aconitase [4Fe-4S], a été étudiée vis à vis d'autres effecteurs que le fer capables de modifier l'activité des IRP. Ainsi des excès assez modestes de diverses espèces réactives de l'oxygène ne peuvent former que l'espèce [3Fe-4S] de la protéine. La doxorubicine, un composé cytostatique utilisé comme anti-cancéreux, a une action sur IRP1, mais elle dépend des conditions d'application et implique certainement des mécanismes multiples. In vitro, IRP1 est complètement activée pour la fixation d'ARN par un fort excès de 2-mercaptoéthanol. Parmi les diverses causes possibles de cet effet, les propriétés de solvant de ce produit (comme de l'éthanol) en sont responsables.
La recherche d'éventuels partenaires physiologiques de la protéine IRP1 a été entreprise par une étude double hybride chez la levure Saccharomyces cerevisiae, mais les constructions utilisées n'ont pas permis de déterminer de candidats potentiels. L'utilisation d'autres constructions ainsi que d'autres systèmes double hybride est envisagée pour la poursuite de cette étude.
Une nouvelle méthode de dosage de l'activité de fixation au motif IRE a été envisagée par l'utilisation d'un substrat fluorescent et de l'électrophorèse capillaire. Les résultats préliminaires obtenus n'ont pas encore abouti, mais ils contribuent à donner des orientations pour le développement de cette méthode présentant de nombreux avantages.
Des changements de conformation entre les deux formes actives de IRP1 ont été analysés par deux méthodes structurales en solution. La formation de certains éléments de structure secondaire d'IRP1 dépend de l'état d'activité de la protéine et ils sont sensibles à la fixation des substrats. Les propriétés hydrodynamiques d'IRP1 varient aussi lors de ces différents changements. Faute de structure à haute résolution, ces informations permettent toutefois de se représenter le comportement structural d'IRP1 dans son rôle de régulateur.
La réactivité de la protéine recombinante IRP1 humaine, purifiée sous sa forme aconitase [4Fe-4S], a été étudiée vis à vis d'autres effecteurs que le fer capables de modifier l'activité des IRP. Ainsi des excès assez modestes de diverses espèces réactives de l'oxygène ne peuvent former que l'espèce [3Fe-4S] de la protéine. La doxorubicine, un composé cytostatique utilisé comme anti-cancéreux, a une action sur IRP1, mais elle dépend des conditions d'application et implique certainement des mécanismes multiples. In vitro, IRP1 est complètement activée pour la fixation d'ARN par un fort excès de 2-mercaptoéthanol. Parmi les diverses causes possibles de cet effet, les propriétés de solvant de ce produit (comme de l'éthanol) en sont responsables.
La recherche d'éventuels partenaires physiologiques de la protéine IRP1 a été entreprise par une étude double hybride chez la levure Saccharomyces cerevisiae, mais les constructions utilisées n'ont pas permis de déterminer de candidats potentiels. L'utilisation d'autres constructions ainsi que d'autres systèmes double hybride est envisagée pour la poursuite de cette étude.
Une nouvelle méthode de dosage de l'activité de fixation au motif IRE a été envisagée par l'utilisation d'un substrat fluorescent et de l'électrophorèse capillaire. Les résultats préliminaires obtenus n'ont pas encore abouti, mais ils contribuent à donner des orientations pour le développement de cette méthode présentant de nombreux avantages.
Des changements de conformation entre les deux formes actives de IRP1 ont été analysés par deux méthodes structurales en solution. La formation de certains éléments de structure secondaire d'IRP1 dépend de l'état d'activité de la protéine et ils sont sensibles à la fixation des substrats. Les propriétés hydrodynamiques d'IRP1 varient aussi lors de ces différents changements. Faute de structure à haute résolution, ces informations permettent toutefois de se représenter le comportement structural d'IRP1 dans son rôle de régulateur.
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