Dévelappement de vecteurs lentiviraux non-intergratifs en vue du transfert de gènes dans le système nerveux central.
Résumé
Les vecteurs lentiviraux sont parmi les plus efficaces et les plus aisés à manipuler en vue du transfert de gènes. Leur application est toutefois fortement compromise par le risque de mutagenèse qui résulte de l'intégration de leur génome dans la chromatine de la cellule cible. Plusieurs stratégies peuvent être envisagées afin de contourner ce risque, l'une d'entre elle est de bloquer l'intégration du génome vecteur et d'utiliser des vecteurs lentiviraux sous forme épisomale.
Nous avons introduit une mutation dans la région C-terminale de l'itégrase de vecteurs dérivés du HIV (262RRK->AAH). Nous avons démontré que ces vecteurs permettent l'expression d'un transgène dans différentes lignées cellulaires in vitro ainsi que dans des cultures primaires de cellules en arrêt de division (astrocytes et neurones). L'expression du transgène est perdue par dilution des génomes non intégrés au cours de la division cellulaire. Elle est au contraire stable dans des cellules en arrêt de division. Nous avons également évalué l'activité résiduelle d'intégration des vecteurs mutants exprimant le gène de résistance au G418 (NEO), elle est réduite de 2 à 3 log par rapport au vecteur contrôle. Enfin, nous avons démontré la capacité de ces vecteurs lentiviraux non-intégratifs à diriger l'expression d'un transgène in vivo dans le système nerveux central de rongeur, pendant au moins 10 semaines après injection dans le striatum de souris et pendant au moins 5 mois après injection sous-rétinienne chez le rat.
Nous avons ensuite entrepris l'amélioration de l'efficacité d'expression du transgène et la réduction de l'activité résiduelle d'intégration. En premier lieu, dans le but d'augmenter l'activité transcriptionnelle des formes épisomales du génome lentiviral, nous avons incorporé des séquences d'attachement à la matrice nucléaire (séquence MAR de la chaîne légère de l'immunoglobuline de souris et séquence MAR du lysozyme de poulet). Nous avons transduit in vitro différentes lignées cellulaires ainsi que des progéniteurs neuraux humains avec des vecteurs lentiviraux non-intégratifs permettant l'expression de la Luciférase. Nous n'avons pas observé d'amélioration significative du niveau d'expression du transgène en présence des séquences MAR.
Parallèlement, nous avons produit des vecteurs portant différentes mutations de l'intégrase (N : 262RRK↑AAH, ou LQ : 186K↑Q, 214Q↑L, 216Q↑L, ou 64D↑V) permettant l'expression de différents transgènes (GFP, LUC, GDNF). Nous avons comparé in vitro l'efficacité de transduction de ces différents vecteurs. Nous avons établi que le vecteur N est moins efficace que les vecteurs D64V et LQ. Nous avons en effet observé un phénomène de saturation de la transduction par le vecteur N. Les vecteurs D64V et LQ permettent une expression comparable du transgène.
Nous avons également produit des vecteurs permettant l'expression du gène NEO portant ces différentes mutations d'intégrase, seules ou en combinaison avec la modification des séquences d'attachement des LTR. Nous avons comparé la fréquence d'intégration résiduelle de ces différents vecteurs et observé que le vecteur D64V présente l'intégration la plus élevée parmi les vecteurs mutants. La fréquence d'intégration est réduite de 1 à 2 log par rapport au vecteur contrôle intégratif tandis qu'elle est réduite de 2 à 3 log pour les vecteurs N et LQ. Par ailleurs, nous n'avons pas observé de réduction significative de l'intégration par la modification des LTR, qu'elle que soit l'intégrase mutée considérée.
Nous avons introduit une mutation dans la région C-terminale de l'itégrase de vecteurs dérivés du HIV (262RRK->AAH). Nous avons démontré que ces vecteurs permettent l'expression d'un transgène dans différentes lignées cellulaires in vitro ainsi que dans des cultures primaires de cellules en arrêt de division (astrocytes et neurones). L'expression du transgène est perdue par dilution des génomes non intégrés au cours de la division cellulaire. Elle est au contraire stable dans des cellules en arrêt de division. Nous avons également évalué l'activité résiduelle d'intégration des vecteurs mutants exprimant le gène de résistance au G418 (NEO), elle est réduite de 2 à 3 log par rapport au vecteur contrôle. Enfin, nous avons démontré la capacité de ces vecteurs lentiviraux non-intégratifs à diriger l'expression d'un transgène in vivo dans le système nerveux central de rongeur, pendant au moins 10 semaines après injection dans le striatum de souris et pendant au moins 5 mois après injection sous-rétinienne chez le rat.
Nous avons ensuite entrepris l'amélioration de l'efficacité d'expression du transgène et la réduction de l'activité résiduelle d'intégration. En premier lieu, dans le but d'augmenter l'activité transcriptionnelle des formes épisomales du génome lentiviral, nous avons incorporé des séquences d'attachement à la matrice nucléaire (séquence MAR de la chaîne légère de l'immunoglobuline de souris et séquence MAR du lysozyme de poulet). Nous avons transduit in vitro différentes lignées cellulaires ainsi que des progéniteurs neuraux humains avec des vecteurs lentiviraux non-intégratifs permettant l'expression de la Luciférase. Nous n'avons pas observé d'amélioration significative du niveau d'expression du transgène en présence des séquences MAR.
Parallèlement, nous avons produit des vecteurs portant différentes mutations de l'intégrase (N : 262RRK↑AAH, ou LQ : 186K↑Q, 214Q↑L, 216Q↑L, ou 64D↑V) permettant l'expression de différents transgènes (GFP, LUC, GDNF). Nous avons comparé in vitro l'efficacité de transduction de ces différents vecteurs. Nous avons établi que le vecteur N est moins efficace que les vecteurs D64V et LQ. Nous avons en effet observé un phénomène de saturation de la transduction par le vecteur N. Les vecteurs D64V et LQ permettent une expression comparable du transgène.
Nous avons également produit des vecteurs permettant l'expression du gène NEO portant ces différentes mutations d'intégrase, seules ou en combinaison avec la modification des séquences d'attachement des LTR. Nous avons comparé la fréquence d'intégration résiduelle de ces différents vecteurs et observé que le vecteur D64V présente l'intégration la plus élevée parmi les vecteurs mutants. La fréquence d'intégration est réduite de 1 à 2 log par rapport au vecteur contrôle intégratif tandis qu'elle est réduite de 2 à 3 log pour les vecteurs N et LQ. Par ailleurs, nous n'avons pas observé de réduction significative de l'intégration par la modification des LTR, qu'elle que soit l'intégrase mutée considérée.
Fichier principal
complet_30_10_07_low.pdf (3.47 Mo)
Télécharger le fichier
Presentation.ppt (22.4 Mo)
Télécharger le fichier
complet_30_10_07_high.pdf (10.65 Mo)
Télécharger le fichier
Format : Autre
Format : Autre