Study of the expression of the nuclear genes encoding human mitochondrial complex I subunits
Étude de l'expression des gènes nucléaires codant pour les sous-unités du complexe I mitochondrial humain
Résumé
NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) is the largest enzymatic complex of the mitochondrial oxidative phosphorylation system (43 human subunits). Few data are available concerning the regulation mechanisms controlling the expression of these proteins.
This thesis started with the study of the promoters of two human complex I genes. The results show that the transcription of NDUFS8 gene encoding the 23 kDa (TYKY) subunit is under the control of the YY1 and Sp1 transcription factors, while the NDUFS7 gene encoding the 20 kDa (PSST) subunit is regulated by NRF-1 and Sp1.
The second part of this study was oriented towards the development of an analytical method of the human mitochondrial proteome by two-dimensional electrophoresis. The aim is to approach the expression of the complex I proteins globally and without a priori: which subunits are regulated in response to an extracellular signal and how ?
Reference human proteome maps were built using mitochondria isolated from placenta in a system involving 2 pH gradients : one for acidic and neutral proteins, one for basic proteins. On
those maps, 85 mitochondrial proteins have been identified using mass spectrometry techniques. Among them, 17 proteins are complex I subunits. Proteomic analysis was then used to study regulation of mitochondrial proteins expression by iron. On a technical point of view, promising results were obtained: high quality 2D-gels were prepared using mitochondria isolated from culture cells and variations in the expression level of complex I and others mitochondrial proteins have been detected. On a biological point of view, preliminary data were obtained. New experiments have toand to analyze the kinetics of the detected variations.
This thesis started with the study of the promoters of two human complex I genes. The results show that the transcription of NDUFS8 gene encoding the 23 kDa (TYKY) subunit is under the control of the YY1 and Sp1 transcription factors, while the NDUFS7 gene encoding the 20 kDa (PSST) subunit is regulated by NRF-1 and Sp1.
The second part of this study was oriented towards the development of an analytical method of the human mitochondrial proteome by two-dimensional electrophoresis. The aim is to approach the expression of the complex I proteins globally and without a priori: which subunits are regulated in response to an extracellular signal and how ?
Reference human proteome maps were built using mitochondria isolated from placenta in a system involving 2 pH gradients : one for acidic and neutral proteins, one for basic proteins. On
those maps, 85 mitochondrial proteins have been identified using mass spectrometry techniques. Among them, 17 proteins are complex I subunits. Proteomic analysis was then used to study regulation of mitochondrial proteins expression by iron. On a technical point of view, promising results were obtained: high quality 2D-gels were prepared using mitochondria isolated from culture cells and variations in the expression level of complex I and others mitochondrial proteins have been detected. On a biological point of view, preliminary data were obtained. New experiments have toand to analyze the kinetics of the detected variations.
La NADH:ubiquinone oxydoréductase (complexe I) est le plus gros complexe enzymatique du système mitochondrial d'oxydation phosphorylante (43 sous-unités chez l'homme). Très peu de données sont disponibles concernant les mécanismes régulant l'expression de ces protéines.
Cette étude a été initiée par l'étude des promoteurs de deux gènes du complexe I mitochondrial humain. Les résultats montrent que le gène NDUFS8 qui code pour la sous-unité 23 kDa (TYKY) est transcrit sous le contrôle des facteurs de transcription YY1 et Sp1 tandis que gène NDUFS7 codant pour la sous-unité 20 kDa (PSST) est régulé par NRF-1 et Sp1.
Dans la deuxième partie de ce travail, une méthode d'analyse du protéome mitochondrial humain par électrophorèse bidimensionnelle a été développée. Le but est d'aborder de manière globale et sans a priori l'expression des protéines du complexe I : déterminer qui est régulé et comment en réponse à un stimulus déterminé?
Des cartes de référence ont été développées à partir de mitochondries extraites de placenta humain en utilisant deux types de gradient de pH : l'un est adapté aux protéines acides et neutres, l'autre aux protéines basiques. Sur ces cartes, 85 protéines mitochondriales ont été identifiées par spectrométrie de masse dont 17 sous-unités du complexe I. Cette technique d'analyse protéomique a ensuite été utilisée pour étudier la régulation de l'expression des protéines mitochondriales par le fer. Sur le plan technique, les premiers résultats sont encourageants : les gels d'électrophorèse bidimensionnelle préparés avec des mitochondries extraites de cellules en culture sont de bonne qualité et des variations reproductibles de l'expression de sous-unités du complexe I et d'autres protéines mitochondriales ont pu être détectées. Sur le plan fondamental, les données obtenues sont préliminaires. Il sera nécessaire de réaliser de nouvelles expériences pour confirmer les premières observations et analyser la cinétique des variations détectées.
Cette étude a été initiée par l'étude des promoteurs de deux gènes du complexe I mitochondrial humain. Les résultats montrent que le gène NDUFS8 qui code pour la sous-unité 23 kDa (TYKY) est transcrit sous le contrôle des facteurs de transcription YY1 et Sp1 tandis que gène NDUFS7 codant pour la sous-unité 20 kDa (PSST) est régulé par NRF-1 et Sp1.
Dans la deuxième partie de ce travail, une méthode d'analyse du protéome mitochondrial humain par électrophorèse bidimensionnelle a été développée. Le but est d'aborder de manière globale et sans a priori l'expression des protéines du complexe I : déterminer qui est régulé et comment en réponse à un stimulus déterminé?
Des cartes de référence ont été développées à partir de mitochondries extraites de placenta humain en utilisant deux types de gradient de pH : l'un est adapté aux protéines acides et neutres, l'autre aux protéines basiques. Sur ces cartes, 85 protéines mitochondriales ont été identifiées par spectrométrie de masse dont 17 sous-unités du complexe I. Cette technique d'analyse protéomique a ensuite été utilisée pour étudier la régulation de l'expression des protéines mitochondriales par le fer. Sur le plan technique, les premiers résultats sont encourageants : les gels d'électrophorèse bidimensionnelle préparés avec des mitochondries extraites de cellules en culture sont de bonne qualité et des variations reproductibles de l'expression de sous-unités du complexe I et d'autres protéines mitochondriales ont pu être détectées. Sur le plan fondamental, les données obtenues sont préliminaires. Il sera nécessaire de réaliser de nouvelles expériences pour confirmer les premières observations et analyser la cinétique des variations détectées.
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