Identification and characterisation of new isoforms of the proto-oncogene c-Cbl and its new roles in apoptosis and cell proliferation
Mise en évidence et analyse de nouvelles isoformes du proto-oncogène c-Cbl et rôle émergeant de ce gène dans la régulation de l'apoptose et de la prolifération cellulaire
Résumé
The proto-oncogene c-cbl is cytoplasmic protein expressed in heamatopoetic tissues and testis, implicated in cellular signalling either as a scaffolding protein and/or as a negative modulator of cellular signalling. Although it has been studied extensively, not much attention was granted to examine it's role in the testis, one of the principal organs of it's expression. We report here that c-Cbl expression in rat and mouse testis is limited to developing germ cells with strongest expression in pachytene spermatocytes and round spermatids and its expression is upregulated by testosterone that can be inhibited by the anti-androgen flutamide. Androgen-regulated apoptosis occurring at the end of meiosis I is markedly lower in the testis of c-Cbl KO mice, while KOc-Cbl Mouse Embryo Fibroblasts (MEFs) show an increased sensitivity to apoptosis provoked by oxidative stress. We also cloned three other isoforms of p120c-Cbl from pachytene spermatocytes, named p115c-Cbl, p90c-Cbl and p85c-Cbl after their expected size, harbouring either one (D1 – p115; D2 - p90) or two (D1 & D2 - p85) deletions. The expression of p120c-Cbl and p115c-Cbl can be detected in testis, lung, spleen, thymus and brain while p90c-Cbl and p85c-Cbl expression seems to be restricted to germ cells. The deletion D1 corresponds to exon 10 (amino acids 459-502), deletion D2 originates from alternative splicing, stretching over exons 11 to 15 (amino acids 514-768). Both deletions contain PR regions with a Grb2 binding site but only p85c-Cbl failed to bind to Grb2, showing that the presence of any of these two sites is sufficient for Grb2 – c-Cbl binding. p90c-Cbl transfected cells had shown increased proliferation compared to the other isoforms. The above results suggest that c-Cbl has a finely regulated role in the regulation of spermatogenesis and some of this regulation is realised through a balance between alternative isoforms.
Le proto-oncogène c-Cbl code pour une protéine cytoplasmique abondamment exprimé dans les tissus hématopoïétiques et testiculaires. Elle possède un rôle de protéine multi-adaptatrice et/ou de régulateur négatif des RTKs. Nous rapportons ici que l'expression majoritaire de c-Cbl dans le testicule de rat et de souris est limité aux cellules germinales et son expression augmente en présence de testostérone et diminue après traitement in vivo par l'anti-androgène flutamide. L'apoptose dépendante des androgènes survenant à la fin de la méïose 1 est notablement moins importante dans le testicule de souris KO pour c-Cbl (c-CblKO). Inversement, le nombre de Fibroblastes Embryonnaires de souris c-CblKO entrant en apoptose sous l'effet du stress oxydatif est bien plus élevé que celui des cellules provenant d'animaux sauvages. Ces résultats indiquent le rôle sur la survenue du processus apoptotique de c-Cbl. Nous avons aussi cloné trois autres isoformes de p120c-Cbl à partir d'extraits de spermatocytes pachytènes, appelées p115c-Cbl, p90c-Cbl et p85c-Cbl, en considération de leur taille déduite. Ces isoformes présentent, par rapport à la p120c-Cbl, soit une délétion (d1 pour la p115c-Cbl; d2 pour la p90c-Cbl) soit les deux délétions combinées (d1 + d2, p85c-Cbl). L'expression de la p120c-Cbl et de la p115c-Cbl a été détectée dans le testicule, le poumon, la rate, le thymus et le cerveau alors que celle de la p90c-Cbl et p85c-Cbl semble être restreinte aux cellules germinales. La délétion d1 correspond à l'exon 10 (acides aminés 459-502) et la d2 s'étend des exons 11 à 15 (acides aminés 514-768), provenant d'épissages alternatifs. Les deux délétions contiennent des régions riches en prolines (PR) possédant pour chacun d'eux un site de liaison à la protéine adaptatrice Grb2. Seule la p85 c-Cbl ne peut pas se lier à Grb2, démontrant que chacun de ces sites de liaison sont suffisants pour que la liaison Grb2-c-Cbl puisse avoir lieu. D'autre part, les cellules transfectées par la p90 c-Cbl prolifèrent plus rapidement que celles transfectées avec les autres isoformes de c-Cbl. L'ensemble de ces résultats montrent que c-Cbl possède un rôle finement régulé dans la spermatogenèse, comme l'atteste l'hypofertilité des animaux c-Cbl KO, et que cette régulation pourrait en parti provenir d'une balance entre les différentes isoformes de c-Cbl.
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