Contribution to the Epstein-Barr virus Structural Genomic Project: The Uracil-DNA Glycosylase and the Nucleic-Acid Metabolism Enzyme
Contribution au projet de génomique structurale du virus d'Epstein-Barr : l'Uracile-ADN Glycosylase et les enzymes du métabolisme des acides nucléiques
Résumé
Epstein-Barr Virus (EBV) is a Human γ –herpesvirus. It is the causative agent of diseases such as Infectious Mononucleosis and it is associated with several immunoproliferative syndromes. Unlike other herpesviruses such as herpes-simplex, there is no treatment against EBV. EBV genome features 86 open-reading frames which are potential targets for a structural genomics approach and for the rational design of new drugs. The first round of selected targets encode for 23 proteins. The main problem we encountered was, unexpectedly, the poor expression and solubility of the majority of the selected targets. Among the 8 soluble proteins we obtained, 5 were crystallized and 4 structures were solved. The main success factor was an individual treatment of each target rather than the use of standard protocols. The Uracil-DNA Glycosylase (UNG) is a DNA repair enzyme. It was impossible to obtain crystals of the protein alone, but crystals diffracting to 2.3 Å grew upon the formation of a complex with a phage-encoded inhibitory protein. The analysis of the structure of this complex shows that the « leucin-loop », a major domain of the active site, features a 7 residue insertion which is common to all γ –herpesvirus. Despite this difference, catalytic constants are similar to other organisms UNGs, suggesting a similar interaction with DNA. Current work and problems associated with other targets is also reported (in particular on the Alkaline Exonuclease).
Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est un γ -herpesvirus humain. Il est responsable de maladies telles que la mononucléose-infectieuse et il est associé à de nombreux
carcinomes et syndromes immunoprolifératifs. A la différence d'autres herpesvirus tel que herpes-simplex, il n'existe actuellement aucun médicament efficace contre EBV. Le génome d'EBV contient 86 cadres de lecture soit autant de cibles potentielles pour une approche de génomique structurale, permettant le développement rationnel de nouvelles thérapies. La première série de cibles sur laquelle nous avons travaillé code pour 23 protéines. De façon inattendue, le principal problème rencontré lors de ce projet fut la faible expression ainsi que l'insolubilité d'une grande partie des cibles.
Parmi les 8 protéines solubles, 5 furent cristallisées à l'issue de quoi, 4 structures furent résolues. La clef de la réussite de ce projet fut un traitement individuel de chaque cible plutôt que l'utilisation de protocoles standards. La partie centrale de ce travail porte sur l'Uracile-ADN Glycosylase (UNG). C'est une enzyme de réparation de l'ADN. Il nous fut impossible d'obtenir des cristaux de la protéine seule, mais, grâce à la formation d'un complexe avec une protéine inhibitrice produite par le phage PBS-2, nous obtînmes des cristaux diffractant à 2.3 Å. La structure de ce complexe nous permis l'expliquer l'organisation de la « boucle leucine », un domaine du site actif, qui comporte une insertion de 7 résidus chez tous les γ-herpesvirus. Malgré cette différence, les constantes catalytiques de l'UNG d'EBV sont proches de celles des autres UNGs ce qui suggère un mécanisme similaire d'interaction avec l'ADN. Le travail sur d'autres cibles et les difficultés qui leur sont
inhérentes est également abordé (notamment l'Alkaline Exonucléase).
carcinomes et syndromes immunoprolifératifs. A la différence d'autres herpesvirus tel que herpes-simplex, il n'existe actuellement aucun médicament efficace contre EBV. Le génome d'EBV contient 86 cadres de lecture soit autant de cibles potentielles pour une approche de génomique structurale, permettant le développement rationnel de nouvelles thérapies. La première série de cibles sur laquelle nous avons travaillé code pour 23 protéines. De façon inattendue, le principal problème rencontré lors de ce projet fut la faible expression ainsi que l'insolubilité d'une grande partie des cibles.
Parmi les 8 protéines solubles, 5 furent cristallisées à l'issue de quoi, 4 structures furent résolues. La clef de la réussite de ce projet fut un traitement individuel de chaque cible plutôt que l'utilisation de protocoles standards. La partie centrale de ce travail porte sur l'Uracile-ADN Glycosylase (UNG). C'est une enzyme de réparation de l'ADN. Il nous fut impossible d'obtenir des cristaux de la protéine seule, mais, grâce à la formation d'un complexe avec une protéine inhibitrice produite par le phage PBS-2, nous obtînmes des cristaux diffractant à 2.3 Å. La structure de ce complexe nous permis l'expliquer l'organisation de la « boucle leucine », un domaine du site actif, qui comporte une insertion de 7 résidus chez tous les γ-herpesvirus. Malgré cette différence, les constantes catalytiques de l'UNG d'EBV sont proches de celles des autres UNGs ce qui suggère un mécanisme similaire d'interaction avec l'ADN. Le travail sur d'autres cibles et les difficultés qui leur sont
inhérentes est également abordé (notamment l'Alkaline Exonucléase).