EXHAUSTIVE CHARACTERIZATION OF PENICILLIN-BINDING-PROTEINS SUBSTUTIONS IMPLICATED IN β-LACTAM RESITANCE OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
CARACTERISATION EXHAUSTIVE DES SUBSTITUTIONS
DE PENICILLIN-BINDING PROTEINS INTERVENANT
DANS LA RESISTANCE AUX β-LACTAMINES CHEZ
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
Résumé
Penicillin-Binding Proteins (PBP) are enzymes catalyzing the final steps of the bacterial cell-wall synthesis and are the targets of the β-lactam antibiotics. There are many amino acid substitutions in PBPs of clinical isolates of Streptococcus pneumoniae resistant to β-lactams, leading to a decrease of the affinity of these enzymes for antibiotics. There are about 40 substitutions in the transpeptidase domain of the two major resistant
determinants PBP2x and PBP1a.
Former studies have described the role of four mutations of PBP2x and three of PBP1a. But these mutations explain only a part of the resistance phenomenon. Only a few mutations may be involved in the loss of affinity of PBPs for β-lactam antibiotics leading to an increase of the resistance level.
To identify all the relevant mutations, a set of automated protocols allowing to do site-directed mutagenesis, expression, purification and functional characterization of enzymes using automated liquid-handling systems was developed. An exhaustive characterization of more than 40 mutants of PBP2x of the highly resistant clinical isolate 5204 was performed using this method. All the relevant substitutions were identified and a new molecular
resistance mechanism to β-lactams was elucidated. Moreover, a functional and phenotypic study of the resistance involving PBP1a was performed.
This work provides a global view on the molecular mechanisms of the PBP-mediated resistance of S.
pneumoniae to β-lactams using an original exhaustive method.
determinants PBP2x and PBP1a.
Former studies have described the role of four mutations of PBP2x and three of PBP1a. But these mutations explain only a part of the resistance phenomenon. Only a few mutations may be involved in the loss of affinity of PBPs for β-lactam antibiotics leading to an increase of the resistance level.
To identify all the relevant mutations, a set of automated protocols allowing to do site-directed mutagenesis, expression, purification and functional characterization of enzymes using automated liquid-handling systems was developed. An exhaustive characterization of more than 40 mutants of PBP2x of the highly resistant clinical isolate 5204 was performed using this method. All the relevant substitutions were identified and a new molecular
resistance mechanism to β-lactams was elucidated. Moreover, a functional and phenotypic study of the resistance involving PBP1a was performed.
This work provides a global view on the molecular mechanisms of the PBP-mediated resistance of S.
pneumoniae to β-lactams using an original exhaustive method.
Les Penicillin-Binding Proteins (PBP) sont des enzymes intervenant dans les étapes finales de la synthèse de la paroi bactérienne et sont les cibles des antibiotiques de la famille des β-lactamines. Dans les souches cliniques de Streptococcus pneumoniae résistantes aux β-lactamines, les PBPs ont de nombreuses mutations qui ont pour effet une diminution d'affinité de ces enzymes pour les antibiotiques. Il y a en moyenne 40 substitutions dans le domaine transpeptidase des deux acteurs majeurs de la résistance PBP2x et PBP1a.
Des études précédentes ont décrit le rôle de quatre mutations de PBP2x et de trois de PBP1a, mais celles-ci ne sont responsables que d'une partie de la résistance. Il n'y a très probablement qu'un nombre restreint de mutations responsables de la perte d'affinité des PBPs pour les β-lactamines ayant pour conséquence une augmentation du niveau de résistance.
Pour identifier toutes les mutations impliquées, une série de protocoles automatisés permettant de faire de la mutagénèse dirigée, de l'expression, de la purification et de la caractérisation fonctionnelle d'enzymes en utilisant des robots de types manipulateurs de liquides ont été développés. L'application de cette méthode nous a permis de réaliser une caractérisation exhaustive de plus de 40 mutations de PBP2x de la souche clinique
résistante 5204. Cette étude a abouti à l'identification de toutes les substitutions clés ainsi qu'à l'élucidation d'un nouveau mécanisme moléculaire de baisse d'affinité de PBP2x pour les β-lactamines. De plus, une étude fonctionnelle et phénotypique de la résistance impliquant PBP1a a été réalisée.
Ce travail apporte une vue globale des mécanismes moléculaires de la résistance de S. pneumoniae aux β-
lactamines impliquant les PBPs en utilisant une méthode exhaustive originale.
Des études précédentes ont décrit le rôle de quatre mutations de PBP2x et de trois de PBP1a, mais celles-ci ne sont responsables que d'une partie de la résistance. Il n'y a très probablement qu'un nombre restreint de mutations responsables de la perte d'affinité des PBPs pour les β-lactamines ayant pour conséquence une augmentation du niveau de résistance.
Pour identifier toutes les mutations impliquées, une série de protocoles automatisés permettant de faire de la mutagénèse dirigée, de l'expression, de la purification et de la caractérisation fonctionnelle d'enzymes en utilisant des robots de types manipulateurs de liquides ont été développés. L'application de cette méthode nous a permis de réaliser une caractérisation exhaustive de plus de 40 mutations de PBP2x de la souche clinique
résistante 5204. Cette étude a abouti à l'identification de toutes les substitutions clés ainsi qu'à l'élucidation d'un nouveau mécanisme moléculaire de baisse d'affinité de PBP2x pour les β-lactamines. De plus, une étude fonctionnelle et phénotypique de la résistance impliquant PBP1a a été réalisée.
Ce travail apporte une vue globale des mécanismes moléculaires de la résistance de S. pneumoniae aux β-
lactamines impliquant les PBPs en utilisant une méthode exhaustive originale.