METHODOLOGICAL DEVELOPMENTS FOR THE CHARACTERIZATION OF DNA-PROTEIN COMPLEXES BY AFM AND STUDY OF DNA-KU INTERACTIONS.
DEVELOPPEMENTS METHODOLOGIQUES POUR LA CARACTERISATION DES COMPLEXES ADN-PROTEINES PAR AFM ET ETUDE DES INTERACTIONS ADN-KU.
Abstract
Atomic Force Microscopy (AFM) opens new perspectives in the study of DNA-protein interactions. My work consisted of developing new methodologies for controlling DNA adsorption on surfaces and enabling the study of the dynamics of the complexes in liquid.
We have characterized the interactions between DNA and the mica surface. We propose a simple model to describe the electrostatic interactions in solution between DNA and mica, considering the role of monovalent and divalent cations. The good correlation with experimental data allows validating referential adsorption conditions and a reversible adsorption method for DNA on nickel-pretreated mica. In parallel we have developed a system of tethers to anchor DNA by its extremities.
The control of these methodologies allows characterizing accessibility in function of the adsorption states. We broach this issue by characterizing bleomycin activity on DNA. This approach on a model system allows characterizing the surface influence in terms of accessibility and activity.
The last part of this work considers the characterization of the interactions of the Ku protein with DNA, in the frame of the study of DNA double-strand break repair. Our approach which combines the contributions of transmission electron microscopy and of AFM shows a cooperative polymerization of Ku along DNA and a very different binding mode on single-stranded DNA. This work shows the interest of molecular imaging for the characterization of target site research mechanisms by proteins.
We have characterized the interactions between DNA and the mica surface. We propose a simple model to describe the electrostatic interactions in solution between DNA and mica, considering the role of monovalent and divalent cations. The good correlation with experimental data allows validating referential adsorption conditions and a reversible adsorption method for DNA on nickel-pretreated mica. In parallel we have developed a system of tethers to anchor DNA by its extremities.
The control of these methodologies allows characterizing accessibility in function of the adsorption states. We broach this issue by characterizing bleomycin activity on DNA. This approach on a model system allows characterizing the surface influence in terms of accessibility and activity.
The last part of this work considers the characterization of the interactions of the Ku protein with DNA, in the frame of the study of DNA double-strand break repair. Our approach which combines the contributions of transmission electron microscopy and of AFM shows a cooperative polymerization of Ku along DNA and a very different binding mode on single-stranded DNA. This work shows the interest of molecular imaging for the characterization of target site research mechanisms by proteins.
La microscopie à force atomique (AFM) ouvre de nouvelles perspectives dans l'étude des interactions ADN-protéines. Mon travail a consisté à développer de nouvelles méthodologies pour contrôler l'adsorption de l'ADN sur les surfaces et permettre l'étude en liquide de la dynamique des complexes.
Nous avons caractérisé les interactions entre l'ADN et la surface de mica. Nous proposons un modèle simple pour décrire les interactions électrostatiques en solution entre l'ADN et le mica, en considérant le rôle des cations monovalents et divalents. La bonne corrélation avec les données expérimentales permet de valider un référentiel de conditions et une méthode d'adsorption réversible de l'ADN sur mica prétraité nickel. Nous avons parallèlement développé un système de plots pour ancrer l'ADN par ses extrémités.
Le contrôle de ces méthodologies permet de caractériser l'accessibilité en fonction des états d'adsorption. Nous abordons cette problématique en caractérisant l'activité de la bléomycine sur l'ADN. Cette approche sur un système modèle permet de caractériser l'influence de la surface en termes d'accessibilité et d'activité.
La dernière partie de ce travail considère la caractérisation des interactions de la protéine Ku avec l'ADN dans le cadre de l'étude de la réparation des cassures double brin. Notre approche qui combine les apports de la microscopie électronique à transmission et de l'AFM met en évidence une polymérisation coopérative de Ku sur l'ADN double brin et un mode de fixation très différent sur l'ADN simple brin. Ce travail montre l'intérêt de l'imagerie moléculaire pour caractériser les mécanismes de recherche des sites cibles par les protéines.
Nous avons caractérisé les interactions entre l'ADN et la surface de mica. Nous proposons un modèle simple pour décrire les interactions électrostatiques en solution entre l'ADN et le mica, en considérant le rôle des cations monovalents et divalents. La bonne corrélation avec les données expérimentales permet de valider un référentiel de conditions et une méthode d'adsorption réversible de l'ADN sur mica prétraité nickel. Nous avons parallèlement développé un système de plots pour ancrer l'ADN par ses extrémités.
Le contrôle de ces méthodologies permet de caractériser l'accessibilité en fonction des états d'adsorption. Nous abordons cette problématique en caractérisant l'activité de la bléomycine sur l'ADN. Cette approche sur un système modèle permet de caractériser l'influence de la surface en termes d'accessibilité et d'activité.
La dernière partie de ce travail considère la caractérisation des interactions de la protéine Ku avec l'ADN dans le cadre de l'étude de la réparation des cassures double brin. Notre approche qui combine les apports de la microscopie électronique à transmission et de l'AFM met en évidence une polymérisation coopérative de Ku sur l'ADN double brin et un mode de fixation très différent sur l'ADN simple brin. Ce travail montre l'intérêt de l'imagerie moléculaire pour caractériser les mécanismes de recherche des sites cibles par les protéines.