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Theses

Identification et caracterisation des Glutaredoxines de la cyanobacterie Synechocystis

Résumé : Le maintien de l'homéostasie rédox des thiols, dépendant du pouvoir réducteur du
NADPH, est un processus vital pour la cellule faisant intervenir deux voies supposées
distinctes : 1) thiorédoxine réductase/thiorédoxines et 2) glutathion
réductase/glutathion/glutarédoxines. En dépit de leur importance, on connaît mal la spécificité
des glutarédoxines et des thiorédoxines [1]. C'est particulièrement vrai chez les organismes
photosynthétiques, dont le métabolisme rédox, dépendant de la photosynthèse, est essentiel à
la biosphère (production d'oxygène, assimilation du carbone et de l'azote inorganiques
nécessaires à la production de biomasse pour la chaîne alimentaire). La photosynthèse,
comme la respiration, produit des molécules oxydantes (les espèces activées de l'oxygène) qui
perturbent, entre autres, l'homéostasie rédox des thiols.
Dans le cas des glutarédoxines, il a été montré, chez les organismes hétérotrophes, que ces
enzymes utilisent le pouvoir réducteur du glutathion (re-réduit par le NADPH via la
glutathion réductase) pour contrôler l'état rédox des thiols des résidus cystéines (Cys) des
protéines (réduire les ponts disulfure inter- ou intra-moléculaires). Les glutarédoxines se
répartissent en deux grandes familles, selon la composition de leur centre rédox actif : les
glutarédoxines à dithiol (possédant un site actif de type CysXXCys) et les glutarédoxines à
monothiol (avec un site actif de type CysXXSer).
Au cours de ma thèse, j'ai analysé, in vitro et in vivo, les glutarédoxines avec un organisme
photosynthétique modèle: la cyanobactérie unicellulaire Synechocystis PCC6803
(Synechocystis), qui possède un petit génome (3,57 Mb) entièrement séquencé et
génétiquement manipulable avec les vecteurs plasmidiques développés au laboratoire.
Synechocystis possède 3 glutarédoxines (Grx): deux à dithiol (Grx1 et Grx2) et une à
monothiol (Grx3). Dans un premier temps, j'ai inactivé les 3 gènes correspondants,
indépendamment ou non. Tous les mutants correspondants (simples, doubles et triple) sont
parfaitement viables, dans les conditions standard de croissance. Par contre, leur tolérance aux
stress diffère de celle de la souche sauvage. Le mutant Dgrx1 est sensible au mercure (HgCl2)
et à l'uranium ((CH3COO)2UO2). Le mutant Dgrx2 est sensible au peroxyde d'hydrogène
(H2O2), au cadmium (CdSO4) et au sélénate (NaSeO4). Le mutant Dgrx3 est sensible au bleu
de méthylène. Le triple mutant Dgrx1Dgrx2Dgrx3 est sensible à chacun des toxiques
précédemment cités, et aussi, de façon spécifique par rapport aux autres mutants, à un excès
(x25) de zinc (ZnCl2). Ces résultats indiquent que les Grx possèdent une certaine sélectivité,
qui s'exerce vraisemblablement au travers d'interactions spécifiques.
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Pour rechercher des partenaires protéiques des Grx, j'ai utilisé un système bactérien de
"double hybride", basé sur 2 plasmides dans lesquels on peut cloner, indépendamment, les
gènes codant pour les protéines "appâts" (chacun des trois gènes grx) et les protéines "proies"
(les partenaires possibles des Grxs). Pour identifier ces dernières, nous avons cloné,
indépendamment, une cinquantaine des gènes impliqués dans métabolisme rédox, sans se
limiter au contrôle de l'homéostasie rédox des thiols. Les 1000 tests d'interaction réalisés
nous ont permis d'identifier 10 interactions totalement nouvelles impliquant des Grx. Ensuite,
j'ai analysé les interactions (1) Grx1-MerA (MerA est la réductase du mercure) et (2)
thiorédoxine réductase-Grx1-Grx2, par une approche multidisciplinaire: (i) mutagenèses
dirigées, tests double hybride et études in vivo; (ii) approche biochimique (GST Pulldown); et
(iii) tests d'activité in vitro.
J'ai montré que l'activité de réduction du mercure de MerA est inhibée, de façon réversible,
par la glutathionylation (fixation d'une molécule de glutathion) d'une cystéine (Cys78) de son
site actif. Grx1 réactive MerA en catalysant la réaction de déglutathionylation du site actif de
MerA. Outre la tolérance de Synechocystis au mercure (HgCl2), j'ai montré que Grx1 et MerA
interviennent également dans la résistance à l'uranium (CH3COO)2UO2.
Parallèlement, j'ai analysé les interactions thiorédoxine réductase-Grx1-Grx2. J'ai montré que
la thiorédoxine réductase est capable de réduire Grx1, qui peut à son tour réduire Grx2. Cette
voie rédox originale compense l'absence de glutathion réductase chez Synechocystis. J'ai
également montré que cette "nouvelle" voie rédox est capable de réduire le sélénate. Ces
résultats in vitro sont confortés par certains de mes résultats qui suggèrent que Synechocystis
répond au sélénate par la formation d'un hétérodimère Grx1-Grx2.
Les deux "nouvelles" voies rédox caractérisées au cours de ma thèse sont particulièrement
intéressantes car elles permettent de relier deux processus rédox, homéostasie rédox des thiols
et détoxication des métaux lourds par réduction, qui n'étaient jusqu'ici pas considérés comme
étant étroitement imbriqués.
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https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00104387
Contributor : Benoit Marteyn <>
Submitted on : Friday, October 6, 2006 - 2:13:43 PM
Last modification on : Wednesday, November 29, 2017 - 3:02:26 PM
Long-term archiving on: : Tuesday, April 6, 2010 - 5:36:30 PM

Identifiers

  • HAL Id : tel-00104387, version 1

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Citation

Benoit Marteyn. Identification et caracterisation des Glutaredoxines de la cyanobacterie Synechocystis. Biochimie [q-bio.BM]. Université Paris Sud - Paris XI, 2005. Français. ⟨tel-00104387⟩

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