Chemical instability in microtubule solutions : study and search for effectors

Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d'effecteurs

Nicolas Caudron (1)

1 Organisation Fonctionnelle du Cytosquelette

Microtubules play a crucial role in cellular organisation and function. Microtubule assembly display puzzling non-linear features, like dynamic instability. Here, we intended first to determine the limiting factors of microtubule assembly, and second to identify new effectors of this process. The kinetics of the reaction were studied in simple experimental conditions, allowing simultaneous and precise measurement of all the parameters of the reaction. Our results indicate that the microtubule nucleation occurs in two steps : rapid and irreversible formation of tubulin oligomers then aggregation of these oligomers into a microtubule. The elongation rate of the microtubule appears to be independent of the GTP-tubulin concentration : this elongation rate is probably limited by structural properties of the microtubules. Finally, microtubule disassembly would occur through catastrophes, and would be triggered by tubulin oligomers. The tubulin oligomers controlling disassembly could possibly be the same as those controlling microtubule nucleation. We then produced tubulin oligomers triggering microtubule nucleation by a moderate covalent crosslinking of microtubules. These oligomers are constituted by lateral interactions of 10 tubulin dimmers, four of which aggregate to form a microtubule. Microtubules assembled in our conditions in the presence of nucleating tubulin oligomers do not spontaneously disassemble : these conditions are suitable to look for catastrophe factors. Finally, we developed an affinity chromatographic procedure to purify tubulin-binding proteins in a native state. Thus, these tubulin partners are amenable to functional tests. Peptide mapping and mass spectrometry allowed us to identify the purified proteins. Some are known to control microtubule assembly, but others are possibly new effectors of microtubule dynamics.

Les microtubules jouent un rôle central dans l'organisation et la vie cellulaire. L'assemblage des microtubules présente des comportements non linéaires et mal compris comme l'instabilité dynamique. Nous avons voulu déterminer les paramètres limitant la réaction d'assemblage des microtubules, puis isoler des effecteurs de cette réaction. Des études cinétiques ont été réalisées dans des conditions expérimentales simples où tous les paramètres de la réaction ont été mesurés. D'après nos résultats, la nucléation des microtubules se produirait en deux étapes : formation rapide et irréversible d'oligomères de tubuline puis assemblage de ces oligomères en microtubules. La vitesse d'élongation des microtubules est indépendante de la concentration en tubuline-GTP : cette vitesse d'élongation est sans doute limitée par les propriétés structurales des microtubules. Enfin, le désassemblage des microtubules se produirait par catastrophes et serait stimulé par des oligomères de tubuline se formant au cours de la réaction. Dans une seconde partie, nous avons produit des oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules par pontage covalent modéré des microtubules. Ces oligomères sont constitués par assemblage latéral de 10 dimères de tubuline et s'agrègent par quatre pour former un microtubule. Les microtubules formés dans nos conditions en présence d'oligomères de nucléation ne désassemblent pas spontanément : ces conditions permettront de rechercher des facteurs de catastrophe. Enfin, nous avons développé une procédure chromatographique pour isoler des protéines liant la tubuline. Les partenaires de la tubuline sont isolés à l'état natif et se prêtent à des tests fonctionnels. L'utilisation des techniques de cartographie peptidique a permis d'identifier les protéines par spectrométrie de masse. Nous avons ainsi isolé des protéines connues pour contrôler la dynamique des microtubules, mais d'autres, inconnues restent à étudier.

Mots clés: Cytoskeleton; Assembly; Oligomers; Effectors

Mots clés: Cytosquelette; Microtubules; Assemblage; Oligomères; Nucléation; effecteurs

Domaines: Biochimie [q-bio.BM]

Nicolas Caudron. Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d'effecteurs. Biochimie [q-bio.BM]. Université Joseph-Fourier - Grenoble I, 2001. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00078986⟩