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Theses

Dynamique spatio-temporelle et régulation de l'activité de la
protéine kinase activée par l'adénosine monophosphate cyclique
dans des préparations de neurones en tranche
et
Les mécanismes cellulaires d'action du GHB dans le thalamus
ventrobasal.

Résumé : Dans le système nerveux central, le principal effecteur de la voie de transduction de l'AMPc
est la protéine kinase activée par l'AMPc (PKA). L'activation de la PKA est impliquée dans de
nombreux processus comme la modulation de l'excitabilité neuronale par phosphorylation de
canaux ioniques, de l'homéostasie cellulaire par phosphorylation de cibles cytosoliques et de la
régulation génique par phosphorylation de facteurs de transcription. La régulation de l'activité de la
PKA ainsi que son activation spatiale et temporelle sont des paramètres indispensables à la
compréhension des mécanismes cellulaires à l'origine des effets de cette voie de seconds messagers.
Faute d'approches méthodologiques adaptées, très peu d'études se sont intéressées à la dynamique
spatiale et temporelle, à la spécificité et à la régulation de l'activité de la PKA dans les neurones.
Grâce aux sondes fluorescentes codées génétiquement, il est possible maintenant d'avoir
accès à ces paramètres. A l'aide d'un vecteur viral, nous avons fait exprimer une sonde sensible à
l'activité PKA (sonde AKAR pour A-kinase activity reporter) dans des préparations de neurones en
tranches. Cette sonde utilise le principe du transfert d'énergie par résonance (FRET) et permet de
mesurer par imagerie ratiométrique l'activité kinase de la PKA. Nous avons montré que la sonde
AKAR2, exprimée dans les neurones, modifie son spectre d'émission en réponse à une stimulation
de la voie AMPc. L'utilisation d'une sonde mutante, dont le site de phosphorylation a été modifié,
démontre que les changements observés dans le spectre d'émission de la sonde AKAR2 sont bien
attribuables à une phosphorylation.
Dans une première partie, nous avons étudié la phosphorylation de protéines cibles de la
PKA dans différents compartiments subcellulaires en réponse à différentes stimulations
extracellulaires. La phosphorylation de la sonde AKAR2, nous a permis de suivre en temps réel
l'activité de la PKA dans le cytosol. Afin de mesurer l'activité de la PKA dans le noyau, nous avons
adressé la sonde AKAR2 en utilisant un signal de localisation nucléaire (NLS). Enfin, la mesure de
l'activité de la PKA à la membrane a été réalisée grâce à l'étude de la phosphorylation des canaux
responsables du courant de l'AHP lente (IsAHP). Nous avons montré que la phosphorylation des
canaux ioniques est plus rapide que la phosphorylation des cibles cytosoliques, elles-mêmes plus
rapide que la phosphorylation des protéines nucléaires. De plus, nous avons montré que l'activité de
la PKA stimulée par l'activation de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) est différente de
l'activation directe des adénylyl cyclases (AC). En effet, l'activation de la PKA résultant de la
stimulation des RCPG produit des amplitudes de phosphorylation plus faible de la sonde AKAR2
dans le cytosol et le noyau.
Dans une deuxième partie, nous avons étudié le rôle des phosphodiestérases de type 4
(PDE4) dans la régulation des réponses β-adrénergiques. L'inhibition des PDE4 produit une
activation de la PKA dans les neurones traduisant ainsi une activité tonique des AC. Nous montrons
également que l'inhibition des PDE4 permet de potentialiser l'activité de la PKA en réponse à de
faibles concentrations d'agonistes β adrénergiques. Cette famille de PDEs, en dégradant l'AMPc,
participe donc à la régulation et la propagation des signaux PKA dans les neurones.
Enfin, au cours de ma thèse, je me suis également intéressé au γ-hydroxybutyrate (GHB)
composé qui est utilisé pour soigner certains troubles du sommeil et provoque chez le rat
l'apparition de signes comportementaux et de tracés encéphalographiques similaires à ceux observés
chez l'humain lors de crises d'épilepsie de type absence. L'ensemble de ces effets du GHB passe
probablement par une action sur la boucle thalamocorticale mais les mécanismes cellulaires à leurs
origines sont inconnus. Nous avons montré grâce à l'utilisation d'enregistrements
électrophysiologiques, que les courants post-synaptiques inhibiteurs sont beaucoup moins sensibles
au GHB que les courants post-synaptiques excitateurs et les courants potassiques à rectification
entrante (GIRK). Cette différence de sensibilité serait à l'origine d'un déséquilibre de la balance
excitation/inhibition reçue par les neurones thalamocorticaux ce qui participerait à la genèse d'une
activité oscillante du potentiel membranaire de ces neurones.
Document type :
Theses
Complete list of metadatas

https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00069635
Contributor : Francoise Tchang <>
Submitted on : Wednesday, July 12, 2006 - 10:16:54 AM
Last modification on : Thursday, December 10, 2020 - 10:55:01 AM
Long-term archiving on: : Monday, September 20, 2010 - 3:52:58 PM

Identifiers

  • HAL Id : tel-00069635, version 2

Citation

Nicolas Gervasi. Dynamique spatio-temporelle et régulation de l'activité de la
protéine kinase activée par l'adénosine monophosphate cyclique
dans des préparations de neurones en tranche
et
Les mécanismes cellulaires d'action du GHB dans le thalamus
ventrobasal.. Neurosciences [q-bio.NC]. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2006. Français. ⟨tel-00069635v2⟩

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