Regulation of the activity and intracellular location of CDC25B phosphatases
REGULATION DE L'ACTIVITE ET DE LA LOCALISATION DES PHOSPHATASES CDC25B
Résumé
Ordered activation of cyclin-dependent kinases (CDK), associated to their regulatory cyclin subunit, controls the progression of eukaryotic cells within the cell cycle. The activity of CDK/cyclin is notably regulated by a balance between inhibitory phosphorylation (Wee, Myt) and activating dephosphorylation by CDC25 phosphatases. In human cells, three dual specificity phosphatases, CDC25A, B and C, are involved in the regulation of these complexes at various stages of the cell cycle. CDC25A is active in G1/S transition while CDC25C controls entry into mitosis. In contrast, CDC25B would operate in S phase as well as at the G2/M transition. The existence of three versions of CDC25B (B1, B2 and B3) resulting from alternative splicing might explain this controversy. In order to study the functions and involvements of each variant of CDC25B, we first studied their regulation by kinase CK2, a kinase which may play a role in G2/M transition. Our in vitro studies indicated that CK2 phosphorylates the three variants of CDC25B, but not CDC25C. Mass spectrometry analysis of CDC25B indicated that at least two residues, serine 186 and 187, are phosphorylated by CK2 in vitro. In addition, CDC25B interacts with CK2 in vivo and in vitro in human and insect cells. Finally, phosphorylation of CDC25B by CK2 increases its phosphatase activity both in vitro and in vivo. Thus CK2 is a positive regulator of the catalytic activity of CDC25B. In the course of the cell cycle or during checkpoint response, CDC25B is also regulated at the level of intracellular location. Indeed, the phosphatase shuttles between cytoplasm and nucleus, and the shuttle may be regulated notably by phosphorylation. We have shown that protein kinase AKT/PKB phosphorylates CDC25B in vitro on serine 353 and leads to cytoplasmic storage. Activation of AKT/PKB by hydrogen peroxide induces the cytoplasmic localization of CDC25B. Mutating serine 353 abolishes CDC25B phosphorylation by ATK/PKB but causes only a delay in cytoplasmic stockpiling of CDC25B, suggesting that other mechanisms participate to this phenomenon. In summary, our studies allowed the identification of two new regulators of CDC25B, CK2 which regulates its catalytic activity, and AKT/PKB which participates to the control of its intracellular location, and have provided a better understanding of the regulation of this phosphatase, even though many other partners still await identification.
L'activation séquentielle des Kinases Dépendantes des Cyclines (CDK), associées à leur sous-unité régulatrice la cycline, contrôle la progression des cellules eucaryotes dans le cycle cellulaire. L'activité des complexes CDK/cycline est notamment régulée par une balance entre phosphorylation inhibitrice (Wee, Myt) et déphosphorylation activatrice par les phosphatases CDC25. Dans les cellules humaines, trois phosphatases à double spécificité CDC25A, B et C sont impliquées dans la régulation de ces complexes en différents points du cycle cellulaire. CDC25A agit à la transition G1/S alors que CDC25C contrôle l'entrée en mitose. Par contre, CDC25B agirait en phase S ainsi qu'à la transition G2/M. L'existence de trois variants de CDC25B (B1, B2 et B3) issus d'un épissage alternatif pourrait expliquer cette controverse. Afin d'étudier les rôles et les implications de chaque variant de CDC25B, nous avons d'abord étudié leur régulation par la protéine kinase CK2, kinase qui pourrait jouer un rôle dans le contrôle de la transition G2/M. Nos études in vitro ont démontré que CK2 phosphoryle les trois variants de CDC25B mais pas la protéine CDC25C. Une analyse par spectrométrie de masse de CDC25B indique qu'au moins deux résidus, les sérines 186 et 187, sont phosphorylés in vitro par CK2. De plus, CDC25B interagit avec CK2 in vitro et in vivo dans des cellules humaines et d'insectes. Enfin, la phosphorylation de CDC25B par CK2 augmente son activité phosphatase in vitro ainsi qu'in vivo. CK2 est donc un régulateur positif de l'activité catalytique des CDC25B. Au cours du cycle cellulaire ou en réponse aux points de contrôle, CDC25B est également régulée au niveau de sa localisation intracellulaire. En effet, la phosphatase réalise une navette entre le cytoplasme et le noyau, navette qui peut être régulée notamment par phosphorylation. Nous avons montré que la protéine kinase AKT/PKB phosphoryle in vitro CDC25B sur la sérine 353 et qu'elle provoque son accumulation dans le cytoplasme. L'activation d'AKT/PKB par le peroxyde d'hydrogène reproduit la relocalisation de CDC25B. Par contre, si la mutation de la sérine 353 abolit sa phosphorylation par AKT/PKB, elle n'induit qu'un retard dans la relocalisation cytoplasmique de CDC25B ce qui indique que d'autres mécanismes participent à ce phénomène. Ainsi nos différents travaux ont permis d'identifier deux nouveaux régulateurs de CDC25B, CK2 qui régule son activité catalytique et AKT/PKB qui participe au contrôle de sa localisation intracellulaire, et nous permettent de mieux comprendre la régulation de cette phosphatase même si de nombreux partenaires doivent encore être identifiés.