Etudes des topoisomérases de type II par micromanipulation d'ADN
Résumé
We have studied the behaviour of type II topoisomerases using a single DNA molecule micromanipulation setup. topoisomerases are enzymes responsible for regulating DNA topology in the cell, especially during replication, transcription, and chromosome condensation. In the first part of this thesis, we introduce the topological formalism required to understand the structure adopted by DNA molecules in solution. Next, we present the standard techniques used to investigate DNA topology. In the second part, we present the micromanipulation setup used to conduct experiments. The apparatus is based on a magnetic trap, which allows measurement of the elastic properties (stretching and twisting) of a single DNA molecule. It also permits braiding two DNA molecules around each other. Therefore, it is well suited to study decatenation or relaxation of DNA supercoiling by type II topoisomerases. In the third part, we relate the results we obtained on different topoisomerase enzymes. We show that single molecule experiments allow detailed analysis of the kinetic cycle of topoisomerases. Furthermore, we investigate and explain the basis of substrate recognition by topoisomerase IV. Finally, we present experiments describing the thermodynamic properties of these enzymes.
Au cours de cette thèse , nous avons étudié le fonctionnement des topoisomérases de type II en utilisant un dispositif de micromanipulation de molécules uniques d'ADN. Les topoisomérases sont des enzyme responsables de la régulation de la topologie de l'ADN in vivo, en particulier lors de la réplication, la transcription et la condensation des chromosomes. Dans une première partie, nous introduisons le formalisme topologique nécessaire à la compréhension de la structure adoptée à grande échelle par la molécule d'ADN, puis nous présentons les techniques usuelles qui permettent d'étudier la topologie de ces molécules. Dans une seconde partie, nous présentons le dispositif de micromanipulation d'ADN que nous avons utilisé. Celui-ci, basé sur l'utilisation de pinces magnétiques, permet de sonder directement les propriétés élastiques en tension et en torsion d'une molécule unique d'ADN, mais aussi d'étudier la caténation ou le tressage de molécules d'ADN. Ainsi, il offre la possibilité d'étudier en temps réel l'activité d'enzymes appelées topoisomérases qui décatènent ou modifient l'état de super-enroulement de l'ADN. Dans la troisième partie, nous présentons les résultats que nous avons obtenus sur différentes enzymes de la classe des topoisomérases de type II. Nous montrons que les expériences de molécules unique permettent une étude très fine du cycle enzymatique des topoisomérases. Par ailleurs, nous mettons en évidence le fait que la topoisomérase 4 opère une reconnaissance de son substrat, basée sur l'angle entre segments dans un croisement d'ADN. Enfin, nous présentons des expériences qui visent à comprendre les propriétés thermodynamiques particulières de ces enzymes.