Etude structurale de macromolécules biologiques par cryomicroscopie électronique, reconstruction tridimensionnelle et recalage de données de cristallographie aux rayons X
Résumé
In biostructure, the discipline of cryoelectron microscopy allows to obtain high resolutions, with specific methods and techniques. In this context, my work focused on the study of one category of molecules, isolated particles with low degree of symmetry, and particularly on respiratory extracellular pigments such as cephalopod hemocyanins (Vampyroteuthis infernalis, Benthoctopus species, Sepia officinalis) and an annelid hemoglobin (Lumbricus terrestris). An empiric approach was selected, and permitted us to differentiate technical information from biological results. The first goal of my thesis was to use a known biological material to work on the different steps of cryoelectron microscopy : samples observation, images analysis, reconstruction, and correction of 3D structures. The second goal was to bring biological answers through these technical advances. At the beginning of my thesis, I used a microscope equipped with a LaB6 crystal, limiting the resolution at a value of 20 Å. Nevertheless, it allowed us to answer to a phylogenetic question (Benthoctopus species and Vampyroteuthis infernalis hemocyanins belong to sister orders), and to demonstrate the role of first, the type of microscope, and second, the electron source. Naturally, the next step was to access to a microscope equipped with a field emission gun. The short periods of access to this type of microscope, the first one is arrived in France in 2000, did not give us the possibility to systematically test all the modes. In spite of this problem, we obtained results that confirmed the advantages of the field emission gun. The boundary of 6-7 Å resolution, corresponding to the partial access to information describing the secondary structure of proteins, is not yet reached, but it is clear for this type of particles that we are on the good way. This progression is partially based on the evolution of methods of images collecting, reconstruction and correction of contrast transfer function.
Parmi les disciplines représentatives de la biostructure, la cryomicroscopie électronique permet, au travers de techniques adaptées, d'atteindre de hautes résolutions. Mon travail a porté sur l'étude d'une catégorie de molécules, les particules isolées à faible degré de symétrie et entre autres sur les pigments respiratoires extracellulaires tels que les hémocyanines de céphalopodes (Vampyroteuthis infernalis, Benthoctopus species, Sepia officinalis) et une hémoglobine d'annélide (Lumbricus terrestris). Une approche empirique a été retenue, et nous a permis de différencier les informations techniques et les données biologiques. Le premier but, basé sur l'utilisation d'un matériel biologique connu, était de travailler sur les techniques d'observation de l'échantillon, d'analyse des images, de reconstruction et de correction des structures. Le deuxième but était d'apporter des réponses de type biologique, par le biais de ces améliorations techniques. Le début de ma thèse fut lié à l'utilisation d'un microscope équipé d'un cristal de LaB6, ne permettant pas de descendre significativement sous la barre des 20 Å. Néanmoins, il nous a permis de répondre à une question de type phylogénétique (Benthoctopus species et Vampyroteuthis infernalis appartiennent à des ordres frères), et de démontrer l'importance du type de microscope et de la source électronique associée. Naturellement, l'étape suivante fut d'accéder à un microscope équipé d'un canon à émission de champ. L'accès sporadique et sur de courtes périodes à ce type de microscope, dont les premiers exemplaires sont arrivés en France en 2000, ne m'ont pas permis de tester systématiquement tous les modes d'utilisation. Malgré tout, les résultats que nous avons obtenu ont validé les avantages de l'émission de champ. Certes, la barre des 6-7 Å de résolution, donnant partiellement accès aux informations relatives à la structure secondaire des protéines, n'a pas encore été atteinte, mais il apparaît que les progrès que nous avons effectués tendent vers cette valeur. Cette progression repose en partie sur l'amélioration des méthodes de collecte des images, de reconstruction et de correction de la fonction de transfert de contraste.
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