Caractérisation Structurale et Fonctionnelle de l'Aquaglycéroporine AQP3 exprimée dans divers Systèmes
Résumé
Proteins of the MIP family are membrane proteins that facilitate water or/and solute transport across biological membranes. The members of this family have been classified in three subgroups according to their sequence similarity and function: the aquaporins contains water selective transport proteins (AQP1, AQP2,...), the aquaglyceroporins are water and solute permeable proteins such as AQP3, and the glycerol facilitators are impermeable to water. We have shown that the glycerol permeability of red blood cell membrane is due to the presence of AQP3. In order to determine parts of the proteins involved in the selectivity, we have constructed chimeras between AQP2 and AQP3. Permeability measurements of oocyte expressing AQP3-AQP2 Cter showed that the C terminal extremity is critical for the transport of water but not for the glycerol one. Comparing the water and glycerol transports of oocytes at various stages of maturation, we have shown that an endogenous channel or transporter was present in immature oocytes. Our interest was then focused on the determination of the oligomerization status of an aquaglyceroporin: AQP3, in different membranes. The known tetrameric structure of AQP1 was observed by velocity sedimentation on sucrose gradient, in contrast, AQP3 was found in much slighter fraction in monomeric and dimeric forms. The dimer seems to be very resistant to SDS and hydrophilic reducing agent treatment. Due to a plausible sensitivity of AQP3 to the non-denaturant detergents used, we could not exclude its tetrameric form in the membrane. The results obtained with electronic microscopy on AQP1 and AQP3 expressing oocyte membrane cryofracture showed that AQP1 and AQP3 IMP sizes were not different enough to suggest another membrane organization.
La famille des protéines MIPs est composée de canaux hydriques et de facilitateurs de glycérol. Parmi les canaux hydriques, certains sont sélectivement perm&ables à l'eau, les aquaporines (AQP1, AQP2,...), et les autres sont également perméables aux petits solutés comme le glycérol: les aquaglycéroporines, dont AQP3 fait partie. Nous avons montré dans un premier temps que la perméabilité au glycérol du globule rouge était due à la présence d'AQP3. Dans l'intention de mieux connaître quels étaient les éléments protéiques impliqués dans la sélectivité des protéines MIPs, nous avons construit des chimères entre AQP2 et AQP3. L'une d'entre elle, AQP3-AQP2 Cter, après expression dans l'ovocyte de Xénope, a permis de montrer que la partie C terminale cytoplasmique est impliquée dans le transport d'eau mais pas dans le transport de glycérol d'AQP3. Nous avons également montré que les ovocytes de xénope non matures possédaient des perméabilités à l'eau et au glycérol supérieurs à celles des ovocytes matures suggérant l'expression d'un canal ou d'un transporteur endogène. Enfin, nous avons envisagé de déterminer pour la première fois la structure quaternaire d'une aquaglycéroporine: AQP3. Alors qu'AQP1 dévoile sa forme tétramérique sur gradient de saccharose, après solubilisation en conditions non dénaturantes, AQP3 sédimente dans des fractions plus légères sous forme d'un monomère et d'un dimère très résistant au SDS et aux agents réducteurs hydrophiles. Nous n'avons pu conclure quant à son organisation dans les membranes du fait de son éventuelle sensibilité spécifique aux détergents non dénaturants utilisés. Nous avons donc engagé des études de microscopie électronique de cryofractures de membranes d'ovocytes exprimant AQP1 et AQP3. Nous en avons déduit que la taille d'AQP3 n'était pas suffisamment différente de celle d'AQP1 pour suggérer une organisation membranaire également différente.
Fichier principal
tel-000040481.pdf (5.37 Mo)
Télécharger le fichier
tel-00004048.pdf (2.14 Mo)
Télécharger le fichier
Format : Autre