Etude du métabolisme des phénylpropanoïdes; analyse de l'interaction de la caféoyl-coenzyme A 3-O-méthyltransférase (CCoAOMT) avec son substrat et caractérisation fonctionnelle d'une nouvelle acyltransférase, l'HydroxyCinnamoyl-CoA : shikimate/quinate hydroxycinnamoyl Transférase (HCT).
Résumé
I have studied two enzymes involved in phenylpropanoid metabolism in plants. The phenylpropanoid pathway leads from phenylalanine, to a large array of compounds involved in the development and interactions with the environment. Among these products are flower pigments, antibiotics (termed phytoalexins) that accumulate in diseased plants, signals implicated in the recognition of microbes, UV irradiation protectants, and the building units of lignin. Lignin is an essential component of wood that provides rigidity to cell walls and impermeability to vascular tissues. It is a three-dimensional polymer comprising three units having in common the same aromatic ring but differing in their degree of methylation and hydroxylation. Caffeoyl-coenzyme A O-methyltransferase (CCoAOMT) is the first of the two O-methyltransferase involved in lignin biosynthesis. This enzyme uses specifically CoA-esters as substrates. My initial work was to characterize the active site of CCoAOMT taking avantage of the fact that animal catechol O-methyltransferases and plant CCoAOMT share about 20% amino acid sequence identity and display common structural features. The crystallographic structure of rat liver catechol O-methyltransferase was used as a template to construct a homology model for tobacco CCoAOMT. Integrating site-directed mutagenesis and substrate specificity data, the three-dimensional model identified several amino acid residues involved in CoA-esters binding. I also characterized a new acyltransferase named hydroxycinnamoyl-CoA: shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase (HCT) involved in phenylpropanoid metabolism. HCT belongs to a plant acyltransferase gene family, the members of which have various functions. In vitro, HCT catalyzed the synthesis of shikimate and quinate esters, shown to be substrates of the cytochrome P450 3-hydroxylase. Finally, I confirmed by spatio temporal analyses and virus-induced gene silencing approach the involvement of HCT in lignin biosynthesis.
Le métabolisme des phénylpropanoïdes est un métabolisme secondaire spécifique au règne végétal. Il conduit, à partir de la phénylalanine, à la synthèse d'une grande variété de substances telles que les anthocyanes, les isoflavonoïdes, les stilbènes, des esters d'acides hydroxycinnamiques, ou encore à la lignine. Ces métabolites secondaires interviennent dans la pigmentation florale ou encore la protection des tissus végétaux contre divers stress biotiques et abiotiques. Quant à la lignine, elle assure rigidité aux parois cellulaires végétales et imperméabilité aux tissus conducteurs. La lignine est un polymère tridimensionnel constitué de trois unités monomériques qui possèdent le même squelette carboné phénylpropane mais diffèrent par leur degré de méthoxylation et d'hydroxylation. Une partie de mon travail de thèse a consisté à étudier la relation structure/fonction de la caféoyl-coenzyme A O-méthyltransférase (CCoAOMT) de N. tabacum, responsable de l'introduction de la première des deux fonctions méthyles. Des études bioinformatiques couplées à des approches de biochimie et de mutagenèse dirigée, nous ont permis de modéliser l'interaction de la CCoAOMT avec son substrat, le caféoyl-CoA. Trois acides aminés du site actif ont notamment été identifiés comme intervenant dans la reconnaissance spécifique de la chaîne latérale de CoA. J'ai également caractérisé, chez N. tabacum, une nouvelle acyltransférase à activité HydroxyCinnamoyl-CoA : shikimate/quinate hydroxycinnamoyl Transférase (HCT) impliquée dans le métabolisme des phénylpropanoïdes. Nous avons montré que l'enzyme HCT recombinante synthétisait, in vitro, les substrats de l'hydroxylation en position 3 du noyau aromatique. De plus, la répression de l'expression du gène HCT par le «VIGS» conduit à un ralentissement de la croissance des plantes, à une perturbation importante du pool d'acide chlorogénique, ainsi qu'à une diminution de la quantité et à une modification de la composition de la lignine synthétisée.
Mots clés
Arabidopsis thaliana
Phénylpropanoïdes
lignine
O-méthyltransférase
modélisation
mutagenèse dirigée
acyltransférase
Nicotiana tabacum
Nicotiana benthamiana
Virus Induced Gene Silencing (VIGS)
VMT
CLHP
immunolocalisation
histochimie
microscopie confocale
esters d'acides quinique et shikimique
esters de CoA
acide chlorogénique
Arabidopsis thaliana.