ROLE DE DEUX ARN DANS LE CONTROLE DE L'EXPRESSION DES GENES: REGULATIONS DE LA REPLICATION DU PLASMIDE R1 PAR UN ARN ANTISENS ET DES GENES DE VIRULENCE DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS PAR L'ARN-III
Résumé
The antisense RNA (CopA) regulates bacterial plasmid R1 replication by controlling the rate of synthesis of the RepA initiator protein. CopA binds its complementary region (CopT) in the 5' untranslated region of repA mRNA. This binding essentially inhibits RepA synthesis and promotes rapid degradation of the mRNA by RNase III. Rapid complex formation is a prerequesite for proper control. We have shown that the two RNAs interact via a loop-loop contact that has to be rapidly converted to form an irreversible and functional complex. This complex is not a full duplex but contains a four-way RNA junction stabilized by a long intermolecular helix. Several binding intermediates leading to the stable complex were characterized, as well as CopA and CopT structural determinants required for this essential conversion step. Thus, we propose a mechanism for stable complex formation, involving several steps in a hierarchical order. This unexpected mode of binding between two complementary RNAs appears to be rather a rule than an exception. Indeed, we have shown that this mechanism is conserved among many R1-related plasmids. RNA-III controls the expression of virulence gene expression in Staphylococcus aureus. The aim of the second part of this thesis was to define the secondary structure of RNA-III in vitro and in vivo, and to define independant functional domains. Combining several in vitro approaches, we established that RNA-III contains 14 stem-loop structures and 3 long-range interactions. We also identified a functional sub-domain involved in the control of protein A expression.
L'ARN antisens CopA régule le taux de réplication du plasmide bactérien R1 en contrôlant la synthèse de la protéine initiatrice de la réplication, RepA. CopA se fixe à sa séquence complémentaire (CopT) dans la région 5' non traduite de l'ARNm repA. Cette interaction induit principalement une inhibition de la traduction de l'ARNm repA et favorise sa dégradation par la RNase III. L'efficacité du contrôle est directement reliée à la vitesse de formation du complexe CopA-CopT. Nous avons montré que les deux ARN interagissent via une interaction de type boucle-boucle, mais que celle-ci doit être rapidement convertie pour former un complexe irréversible et fonctionnel. Celui-ci n'est pas un duplexe étendu mais contient une jonction à quatre hélices stabilisée par une longue hélice intermoléculaire. Plusieurs intermédiaires réactionnels menant au complexe stable ont été caractérisés, ainsi que les déterminants structuraux de CopA et de CopT nécessaires à cette conversion qui est essentielle au contrôle. Ainsi, nous proposons un mécanisme de formation du complexe stable qui implique plusieurs étapes dans un ordre hiérarchique. Ce mode d'appariement ARN-ARN insoupçonné apparaît être une règle plutôt qu'une exception. En effet, nous avons montré qu'il est conservé dans de nombreux plasmides homologues à R1. L'ARN-III contrôle l'expression des gènes de virulence chez Staphylococcus aureus. Cette deuxième partie de mon travail de thèse a eu pour but de déterminer la structure secondaire de cet ARN en solution et in vivo, et de définir des domaines fonctionnels. En combinant différentes approches in vitro, nous avons établi que l'ARN-III contient 14 structures en tige-boucle et trois interactions à longue distance. Nous avons également identifié un sous domaine fonctionnel impliqué dans le contrôle de la synthèse de la protéine A.
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