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Fiche détaillée Thèses
Université Joseph-Fourier - Grenoble I (31/10/2008), Jacques Bourguignon (Dir.)
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Etude proteomique de la vacuole d'Arabidopsis thaliana en vue de l'identification d'acteurs protéiques impliqués dans la détoxication du cadmium
Florent Villiers1

La vacuole est un organite qui joue un rôle important dans de nombreux processus de la cellule végétale, et en particulier dans la protection contre les toxiques cellulaires. Parmi ceux-ci, le cadmium est un polluant courant qui affecte les fonctions physiologiques de la plante. La vacuole est connue pour sa capacité à séquestrer les ions métalliques présents dans le cytosol. Toutefois, les acteurs protéiques de cette compartimentation, et notamment les transporteurs, ne sont pas bien connus. Afin de mieux comprendre le rôle de cet organite dans les mécanismes de protection contre le stress métallique, nous avons mis en place une série d'outils d'analyse du protéome vacuolaire, dans le but de réaliser une caractérisation protéomique de référence de cet organite, utile pour l'étude de sa dynamique en conditions de stress. Mon travail a consisté dans un premier temps à mettre au point une méthode de purification de vacuoles à partir de cellules en culture d'Arabidopsis thaliana. La pureté des échantillons obtenus a été confirmée à l'aide de tests biochimiques (western-blots et mesures d'activités enzymatiques) et nous avons pu initier l'analyse par spectrométrie de masse des constituants protéiques de la membrane et de la fraction soluble de la vacuole. Celle-ci a permis d'identifier 689 protéines non-redondantes, dont 110 transporteurs. La localisation in vivo de 5 d'entre elles a été réalisée via l'expression in planta de ces protéines fusionnées à la GFP. Cette première approche protéomique a été complétée d'une étude plus approfondie du protéome vacuolaire, visant à en acquérir des notions quantitatives et organisationnelles. Pour cela, des gels d'électrophorèses bidimensionnelles (IEF / SDS-PAGE) ont été réalisés à partir de la fraction soluble des vacuoles. Les spots résolus ont été quantifiés via le logiciel d'analyse d'images PDQuest et identifiés par spectrométrie de masse. Cette étude a permis de mettre en évidence un certain nombre de protéines majeures de ce compartiment et a porté le nombre total de protéines vacuolaires identifiées par nos travaux à 709. Quelques protéines connues pour être cytosoliques ont toutefois été retrouvées, et une cartographie du protéome cytosolique a également été réalisée afin de la comparer avec celle du protéome soluble de la vacuole et tenter de mieux comprendre l'origine de ces protéines. Cette analyse a été complétée d'une expérience préliminaire de digestion de vacuoles intactes par la protéinase K. Les résultats obtenus suggèrent la présence de protéines à l'intérieur de la vacuole (probablement en cours de dégradation), et d'autres associées à la face externe du tonoplaste probablement de façon spécifique. Enfin, la présence de complexes protéiques a été évaluée à travers la réalisation d'électrophorèses en conditions non dénaturantes qui ont permis de retrouver des complexes connus (ATPase vacuolaire) mais aussi de mettre en évidence plusieurs complexes putatifs de protéines diverses (protéases, glycosidases ...). Un dernier aspect de mon travail a enfin consisté à développer un outil informatique d'exploitation de données d'analyses à haut débit. La confrontation, grâce à cette structure, des résultats de protéomiques vacuolaires et d'autres d'expression génique lors d'un stress cadmium ont permis d'identifier des protéines présentes dans (ou associées à) la vacuole dont le niveau de transcrit est modulé lors d'un stress. Ces analyses croisées ont notamment mis en évidence la protéine DWARF1, qui catalyse une étape de la biosynthèse des brassinostéroïdes, une classe d'hormones. L'étude de l'implication de cette hormone a alors montré que celle-ci est capable de moduler la tolérance au cadmium de plantules, très probablement via des mécanismes qui n'ont encore jamais été identifiés. L'ensemble de ce travail constitue une base pour l'étude ultérieure de la dynamique du protéome vacuolaire. Il propose des méthodes et des outils d'analyse, ainsi qu'une série de données de référence, pour mieux comprendre les processus vacuolaires de la détoxication métallique, et a d'ores et déjà permis de mettre en évidence des aspects nouveaux du fonctionnement de cet organite.
1 :  LPCV - Laboratoire de physiologie cellulaire végétale
cadmium – vacuole – proteomique – brassinosteroides

Proteomic study of the Arabidopsis thaliana vacuole in order to identify protein actors involved in cadmium detoxification
The vacuole is an organelle playing an important role in several plant cellular processes including protection against toxins. Among these, cadmium is a major pollutant, affecting plant physiology, and the vacuole is known for its capacity to store it. However, proteins involved in the transport across the tonoplast and in the chelation of cadmium inside the vacuoles are not well known. To better understand the function of this organelle we initiated a proteomics study to characterize vacuoles from Arabidopsis thaliana cells. This has allowed setting up tools and methods useful to study the dynamics of this proteome as a function of a cadmium exposure. In the first part of my work, a procedure was developed to prepare highly purified vacuoles from protoplasts isolated from Arabidopsis thaliana cell cultures using Ficoll density gradients. Absence of significant contamination by other cellular compartments was validated by Western-blot and enzymatic measurements. Based on these results, vacuole preparations showed the necessary degree of purity for proteomics study. Therefore, the protein components present in both membrane and soluble fractions of the Arabidopsis cell vacuoles were analysed, leading to the identification of 689 proteins including 110 transporters. The subcellular localization of several putative vacuolar proteins was confirmed by transient expression of green fluorescent protein-tagged fusion proteins. This first work was completed by a more extensive study of the vacuole proteome, in order to analyse it at a quantitative and organisational levels. IEF / SDS-PAGE were performed with the soluble proteins of vacuoles, resolved spots were quantified using PDQuest software and identified by mass spectrometry (collaboration with LEDyP, CEA Grenoble). Some proteins that were not identified in the previous study were found, leading to a list of 709 vacuolar proteins, among which some cytosolic proteins were identified. A map of a cytosolic protein-enriched fraction was made and compared with that of the soluble vacuolar proteome in order to understand the origin of the presence of the cytosolic proteins in our samples. These data combined with those from partial digestion experiments of intact vacuoles (performed with proteinase K) suggest that the main part of these cytosolic proteins are localized outside the vacuoles and are co-purified because of specific interactions of these proteins with the tonoplast. Some of them are also inside the vacuole, probably in the process of being degraded. Finally, supramolecular organization of the vacuolar proteome was evaluated using native electrophoresis (BN-PAGE), and putative isolated complexes were identified by mass spectrometry. These experiments confirmed the presence of some known complexes (vacuolar ATPase for example) and suggested new complexes containing proteases and/or glycosyl hydrolases. A last aspect of my work was the development of an informatics tool, designed to store and exploit data from high throughput analyses. Such a structure has allowed cross-analysis of data from vacuolar proteomics work together with those from microarray transcriptomics experiments. This led to the identification of several vacuolar proteins transcriptionally regulated during cadmium stress. Among them, DWARF1, which catalyses a key step in the brassinosteroids pathway, was selected to further analyse its possible implication in the mechanisms of cadmium response. We observed that brassinosteroids modulate Arabidopsis thaliana seedlings' response to cadmium, and that this mechanism could not be linked to any known tolerance process, suggesting the existence of a new tolerance / sensitivity factor. This work is a basis for the study of the changes occuring in the vacuolar proteome under cadmium stress, which should lead to a better comprehension of this organelle's involvement in plant response to heavy metals. We set up new methods and tools, and obtained several results that highlight new aspects of plant vacuole physiology.
cadmium – vacuole – proteomics – brassinosteroids