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Fiche détaillée Thèses
Université de Grenoble (20/12/2010), Uwe Schlattner (Dir.)
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Sacnicte-RAMIREZ-RIOS-These-2010.pdf(8.9 MB)
La protéine kinase activée par AMP : Criblage de nouveaux substrats membranaires et phosphorylation de la créatine kinase liée à une compartimentation subcellulaire
Sacnicte Ramirez Rios1

Divers stimuli tels que l'ischémie, l'hypoxie et l'exercice peuvent induire la déplétion en ATP provoquant une déregulation de l'homéostasie énergétique. Cependant, les cellules disposant de mécanismes compensatoires pour contrebalancer et compenser le déficit de l'état énergétique cellulaire. Deux enzymes clés participent à la régulation du métabolisme énergétique cellulaire. La créatine kinase (CK) peut réagir immédiatement comme transporteur d'énergie. D'autre part la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK), régule au niveau cellulaire et du corps en entier la livraison et la consommation d'énergie. Dans ce travail de thèse, les outils de base pour realiser un criblage des cibles de l'AMPK ont d'abord été mis en place. Ce sont les protocoles multidimensionnelles pour la purification de protéines par HPLC et le criblage in vitro de cibles membranaires de l'AMPK, dont le sous-fractionnement des membranes et la separation par électrophorèse de type blue native PAGE. Différents candidats potentiels de l'AMPK ont été obtenus, et deux ont été confirmés par phosphorylation in vitro. Ensuite, une interaction entre les deux enzymes, l'AMPK et la CK, a été confirmée pour la première fois in vitro et in vivo. L'AMPK phosphoryle la créatine kinase cytosolique du cerveau (BCK) sur la serine 6 in vitro et in vivo. Cette phosphorylation a été mis en evidance à l'aide de tests de phosphorylation et d'un anticorps généré spécifique de la phospho-Ser6. Le system de double hybride en levure a montré que cette phosphorylation est acompagné par une interaction transitoire impliquant spécifiquement l'AMPK active et BCK non phosphorylé. La phosphorylation médiée par AMPK n'affecte pas l'activité enzymatique de BCK mais localise la kinase dans le réticulum endoplasmique (RE) in vivo. Le travail presente dans ce manuscript confirme une interaction entre les deux enzymes clefs dans l'homeostasis energetique. La caracherization in vitro et in vivo de la phosphorylation de la BCK par l'AMPK suggère que l'AMPK regule probablement l'associattion de BCK aux compartements subcellulaires et pas l'activité enzymatique. Cette localisation est induite par l'AMPK en cas de stress énergetique et peut soutenir des processus fortement dépendant de l'ATP dans ce microenvironnement, comme par exemple le pompage de calcium.
1 :  LBFA - Laboratoire de bioénergétique fondamentale et appliquée
protéine kinase activée par l'AMP – system de double hybride en levure – creatine kinase – HPLC.

AMP-activated protein kinase : Screening for novel membrane substrates and creatine kinase phosphorylation linked to specific subcellular compartment
Various stimuli such as ischemia, hypoxia and exercise can induce ATP depletion evoking impaired energy homeostasis which becomes physiologically relevant at high workloads. Interestingly, cells dispose of compensatory mechanisms to counteract and compensate for the deficit in cellular energy state. Two key enzymes take center stage in the regulation of cellular and whole body energy metabolism. Creatine kinase (CK) can reacts immediately as an energy buffer and transport system in the cell with fluctuating energy demands to maintain cellular energy homeostasis while AMP-activated protein kinase (AMPK) is acting via regulation of downstream targets affecting more medium and long term adaptations in the cell to relieve energy stress. In this thesis work, first, basic tools for screening AMPK substrates have been established, including multidimensional protocols for HPLC protein purification and in vitro screening of putative AMPK membrane targets, including subfractionation of membranes and blue native-SDS-PAGE. As a proof of principle, different putative novel substrate candidates were obtained, and two confirmed by in vitro phosphorylation. Second, a putative interplay of both enzymes, AMPK and CK, has been confirmed for the first time in vitro and in vivo. Cytosolic brain-type creatine kinase (BCK) was identified as an AMPK target phosphorylated at serine 6 in vitro and in vivo by using phosphorylation assays and a generated phospho-Ser6-specific antibody. Phosphorylation is accompanied by transient interaction specifically involving activated AMPK and non-phosphorylated BCK as shown with yeast two hybrid assays (Y2H). AMPK-mediated phosphorylation of BCK does not affect enzyme kinetics, but localizes the kinase to the endoplasmic reticulum (ER) in vivo. The work presented in this thesis confirms an interplay between key kinases in energy homeostasis. Taken together our results suggest that AMPK seems to regulate more probably the association of BCK to subcellular compartments and not enzyme activity. Although it is unknown yet, the physiological role of BCK in the endoplasmic reticulum (ER), we can hypothesis that ER-localization of BCK induced by AMPK under energy stress may support heavily ATP-dependent processes in this microenvironment like e.g. calcium pumping.
AMP-activated protein kinase – yeast two hybrid – brain-type creatine kinase – HPLC.