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Thèses

Université de Grenoble (20/12/2010), Ludovic Pelosi (Dir.)

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Etude conformationnelle de protéines membranaires mitochondriales modèles chez Saccharomyces cerevisiae : Analyses des relations structure/fonction du transporteur d'ADP/ATP et de l'accessibilité au solvant de la porine VDAC

Benjamin Clemençon1

Les transporteurs d'ADP/ATP (Ancp) et de phosphate inorganique (PiC) ainsi que la porine VDAC représentent les principaux maillons d'une machinerie de transport d'ADP, d'ATP et de phosphate inorganique à travers la double membrane mitochondrial. Actuellement, les connaissances relatives aux mécanismes moléculaires mis en jeu dans cette machinerie accusent un retard. L'objectif de ce projet de Thèse a été d'amener de nouveaux éléments sur l'état conformationnel de ces protéines étudiées dans la levure Saccharomyces cerevisiae, modèle biologique où la génétique est facilitée. La majeure partie de ce projet a concerné l'Ancp de levure qui assure l'échange d'ADP cytosolique contre de l'ATP matriciel néosynthétisé suite aux processus de phosphorylation oxydative. Il peut être inhibé spécifiquement par deux poisons naturels, le carboxyatractyloside (CATR) et l'acide bongkrékique (BA) qui stabilisent la protéine dans deux états conformationnels distincts adoptés lors du mécanisme de transport. Afin de mieux comprendre cette dynamique, une étude comparative des deux conformères a été réalisée en combinant l'échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse (HDX-MS) aux outils biochimiques directement liés à l'étude des Ancp. Les résultats obtenus corrèlent l'hypothèse d'une structure malléable du transporteur dans laquelle des changements conformationnels importants interviennent. D'autre part, ce projet a permis d'obtenir les premières données d'accessibilité au solvant du PiC. Enfin, l'étude en HDX-MS de VDAC, nous a permis de montrer que son accessibilité au solvant en solution de détergent était en accord avec les données structurales publiées récemment.

1 :	laboratoire de biochimie et biophysique des Systèmes Intégrés

mots-clés : Transporteur d'ADP/ATP Transporteur de phosphate VDAC CATR BA Echange H/D Spectrométrie de masse Saccharomyces cerevisiae

Conformational study of mitochondrial membrane-bound proteins in Saccharomyces cerevisiae: Structure/function relationships of the ADP/ATP carrier and solvent accessibility analysis of the VDAC porin

The ADP/ATP (Ancp) and phosphate inorganic (PiC) carriers as well as the VDAC porin catalyze import and export of ADP, ATP and Pi across the mitochondrial membranes. Characterization of this mechanism at the molecular level is not well understood. The main goal of this work concerns the study of the conformational state of theses proteins in detergent solution purified from the yeast Saccharomyces cerevisiae where the genetic is easier. The major part of this project concerned the Ancp located in the inner mitochondrial membrane that catalyzes the transmembrane exchange of ADP and ATP between the cytosolic and the matrix compartments. ADP/ATP transport is achieved by interconversion of Ancp between two conformational states that are fixed by the specific transport inhibitors carboxyatractyloside (CATR) and bongkrekic acid (BA). Conformational dynamics of the Ancp was investigated by hydrogen/deuterium exchange coupled to mass spectrometry (HDX-MS). The data were compared to those obtained using molecular and biochemical approaches. Our results suggest a flexible structure of the carrier and a real synergy between each side of the carrier during the transport mechanism of nucleotides. On the other hand, these work provided the first data about the solvent accessibility of PiC. Finally, the study of VDAC in HDX-MS allowed us to show that its solvent accessibility in detergent solution corroborated the structural data published previously.

tel-00577042, version 1

http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00577042

oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00577042

Contributeur : Benjamin Clemençon <>

Soumis le : Mercredi 16 Mars 2011, 09:33:01

Dernière modification le : Mercredi 16 Mars 2011, 13:14:46