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Fiche détaillée Thèses
Université Joseph-Fourier - Grenoble I (02/04/2009), Stefan Dimitrov (Dir.)
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Etudes sur le mécanisme de remodelage des nucléosomes par RSC et SWI/SNF
Manu Shubhdarshan Shukla1

Dans les cellules eucaryotes l'ADN nucléaire est organisé sous la forme de chromatine, dont l'unité de répétition est le nucleosome. En règle générale, la chromatine est considérée comme répressive pour les processus nécessitant un accès à l'ADN tels que la transcription, la réplication ou la réparation. Le nucléosome représente une forte barrière pour des protéines nécessitant l'accès à l'ADN. Pour surmonter cette barrière, la cellule a développé des méthodes variées, dont la plus importante semble être le remodelage des nucléosomes dépendant de l'ATP. Une propriété commune à tous ces facteurs de remodelage est leur capacité de repositionner les nucléosomes le long de l'ADN.

Dans ce travail, nous avons étudié le mécanisme de déplacement des nucléosomes par RSC et SWI/SNF, deux facteurs de remodelage de levure bien caractérisés. Nous avons combiné des approches basées sur la visualisation à haute résolution, notamment la microscopie à force atomique (AFM) et la cryo-microscopie électronique, avec des approches nouvelles à pointe de la biochimie et de la biologie moléculaire.

Nous avons montré que la mobilisation des nucléosomes par RSC ou SWI/SNF implique des espèces réactionnelles intermédiaires métastables dont l'existence et la structure étaient jusqu'alors inconnues. Ces particules nucléosomales, que nous avons nommé ‘remosomes', possèdent certaines propriétés structurales distinctes des nucléosomes canoniques. En particulier, les ‘remosomes' contiennent ~180 pb d'ADN associées à l'octamère d'histones au lieu de 147 pb pour les nucléosomes canoniques. En utilisant, l'empreinte à la DNase I nous avons montré que le ‘remosome' représente un ensemble de structures multiples caractérisées par un enroulement fortement perturbé de l'ADN sur l'octamère d'histones. Pour caractériser ces ‘remosomes' avec une grande précision, nous avons mis au point une nouvelle technique « one pot in gel assay » qui consiste à cartographier toutes les 10 pb l'accessibilité d'une enzyme de restriction au ‘remosome' fractionné. L'application de cette technique a révélé que le profil de l'accessibilité du ‘remosome' est très différent de celui du nucléosome. Alors que celui du nucléosome peut être extrapolé par une fonction de type hyperbolique, le profil du ‘remosome' est ajusté par une fonction parabolique.

Nous avons voulu répondre à la question du mécanisme de l'inhibition de la mobilisation du nucléosome variant H2A.Bbd par SWI/SNF. En utilisant les techniques décrites plus haut sur des nucléosomes variants ou chimériques (contenant des délétions ou translocations de domaines d'histones) nous avons montré que le domaine d'accrochage (‘docking domain') de l'histone H2A est essentiel pour la mobilisation des nucléosomes. Nous avons aussi montré que l'incapacité du nucléosome à glisser est due à la génération d'états intermédiaires ‘remosomes erronés', distincts de ceux apparaissant dans le cas du nucléosome conventionnel.
1 :  Institut d'oncologie/développement Albert Bonniot de Grenoble
Variants d'histones – remodelage de la chromatine – nucléosome – RSC – SWI SNF – chromatine – H2A.Bbd

Studies on the mechanism of nucleosome remodeling by RSC and SWI/SNF
In eukaryotic cell the DNA is organized in the nucleus in the form of chromatin, the fundamental unit of which is called as the nucleosome. Organization of DNA into the nucleosomes presents a strong barrier for various processes which require access to the DNA like transcription, replication and repair. To overcome this problem cells utilize a variety of methods, ATP dependent chromatin remodeling being one of the most important of them. A common feature of all the remodelers is that they are able to reposition the nucleosomes along the DNA at the expense of ATP.

In the present work, we have studied the mechanism of nucleosome mobilization by RSC and SWI/SNF, two well characterized remodelers from yeast. A combinatorial approach was employed using high resolution microscopy namely Electron cryo-Microscopy (EC-M) and Atomic Force Microscopy (AFM) together with novel biochemical approaches. We have shown that the nucleosome mobilization by RSC and SWI/SNF involves hitherto unknown intermediate structures. These remodeled nucleosome particles ‘The Remosomes' possess characteristic structural features. Our AFM studies show that ~180 bp of DNA is associated with the histone octamer as compared to ~147 bp in the canonical nucleosomes. Using DNaseI footprinting and EC-M we have shown that the path of DNA around the histone octamer is highly perturbed. Moreover, these particles represent an ensemble many different structures rather than one defined specie. The novel ‘in gel one pot assay' showed that accessibility profile of these particles is completely different from that of canonical nucleosomes and they are accessible all along the path of DNA.

We have also addressed the question of inhibition of nucleosome mobilization due to incorporation of histone variant H2A.Bbd in the nucleosomes. We show that the docking domain of histone H2A is essential for SWI/SNF and RSC induced nucleosome sliding. Furthermore, we demonstrate that the reason for inability of these nucleosomes to slide is due to a faulty generation of ‘Remosome' intermediates.
Histone variants – chromatin remodeling – nucleosome – RSC – SWI/SNF – chromatin – H2A.Bbd