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Fiche détaillée Thèses
Université Joseph-Fourier - Grenoble I (22/01/2007), Yves Jouanneau et Vivian Stojanoff (Dir.)
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Etude structurale de métalloprotéines à centres [2Fe-2S].
Cas d'une ferrédoxine et d'une dioxygénase impliquée dans la biodégradation des
hydrocarbures aromatiques.
Cristallographie des protéines à très haute énergie.
Méthodes de phasage d'une protéine modele à 55 keV.
Jean Jakoncic1, 2

Les métalloprotéines contenant des centres Fe-S jouent un rôle important dans la
nature car elles sont impliquées dans des fonctions physiologiques essentielles telles que la
photosynthèse, la respiration et la fixation de l'azote.
Dans cette thèse, une ferrédoxine impliquée dans la biogenèse des centres Fe-S, et une
dioxygenase bactérienne jouant un rôle crucial dans la biodegradation des hydrocarbures
aromatiques ont fait l'objet d‘analyses structurales par cristallographie aux rayons X. La
structure d'une ferrédoxine de la bactérie photosynthétique Rhodobacter capsulatus, a été
résolue dans les états oxyde et réduit. De petits changements structuraux ont été observes lors de la réduction, notamment au voisinage du centre [2Fe-2S]. Ces changements sont compares a ceux décrits pour des ferrédoxines de structure similaire mais de fonction différente.
Une métalloprotéine plus complexe, appartenant a une grande famille de dioxygenases
bactériennes, a été étudiée pour son activité d'oxydation des hydrocarbures aromatiques
polycycliques (HAP). Cette enzyme a trois composantes, isolée d'une souche de
Sphingomonas dégradant les HAP comprend une oxydoréductase a NAD(P)H, une
ferrédoxine a centre [2Fe-2S], et composante oxygenase de six sous-unités assemblées en un hexamère de type α3β3. La composante oxygenase, appelée PhnI, contient une centre [2Fe-2S] de type Rieske et un ion ferreux par sous-unité α, qui ont été identifies par leur signature RPE. L'enzyme est douée d'une spécificité du substrat extrêmement large, puisqu'elle est capable d'hydroxyle toute une gamme de HAP fait de 2 a 5 cycles aromatiques, y compris des cancérogènes comme le benz[a]anthracene et le benzo[a]pyrene. Avec le naphtalène comme substrat, des mesures de cinétique ont montre que cette enzyme a un Km bas (0.92 WM) et une constante de spécificité de 2.0 WM-1. s-1. La proteine Phn1 a été cristallisée, et sa structure 3D a été résolue avec une résolution de 1.85 A. En dépit d'une modeste similitude de séquence avec des dioxygenases homologues, le repliement polypeptidique est très semblable.
Des différences ont toutefois été observées au niveau de la poche catalytique.
Les protéines sous forme cristallisée, notamment les protéines Fe-S, peuvent subir des
dommages dus au rayonnement X synchrotron, causant des artefacts lors de la détermination
de la structure. Pour essayer de palier cet inconvénient, des rayons X de très haute énergie (55 keV; 0.22 A), qui sont peu absorbes par les protéines, ont été utilises pour résoudre la
structure d'une proteine modèle, le lysozyme. Une structure a été établie pour la première fois
par cette approche, en utilisant les phases expérimentales obtenues par différentes méthodes.
Les applications potentielles en biologie structurale sont discutées.
1 :  BBSI - Biochimie et biophysique des systèmes intégrés
2 :  BNL NSLS - Brookhaven National Laboratory Mational Synchrotron Light Source
métalloprotéines – ferrédoxine – centres fer-soufre – dioxygénase – biodégradation des hydrocarbures – rayonnement synchrotron – cristallographie de rayons X

Structural studies of metaloenzymes containing a [2Fe-2S] cluster.
A ferredoxine and a dioxygenase involved in the biodegradation of aromatic hydrocarbons.


Protein crystallography at ultra high energy.
Phasing methods of a model protein at 55 keV
Metalloproteins containing Fe-S clusters play an important role in nature as they are
involved in essential physiological functions including photosynthesis, respiration, and
nitrogen fixation. In this thesis, a [2Fe-2S] ferredoxin involved in Fe-S cluster biogenesis, and
a bacterial dioxygenase playing a critical role in aromatic hydrocarbon biodegradation were
subjected to structural analysis by synchrotron X-ray crystallography. The structure of a
ferredoxin from the photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus was solved in both its
oxidized and reduced states. Subtle structural changes were observed upon reduction,
especially in the vicinity of the [2Fe-2S] cluster. These changes are discussed in comparison
with those described for ferredoxins with similar structures but different functions.
A more complex metalloprotein, belonging to a large family of bacterial dioxygenases,
was studied for its ability to oxidize polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). This multicomponent
enzyme, isolated from a PAH-degrading Sphingomonas strain, consists of a
NAD(P)H-oxidoreductase, a [2Fe-2S] ferredoxin, and a terminal oxygenase. The terminal
oxygenase component, called PhnI, consists of six subunits assembled into an ?3?3 hexamer,
and contains one Rieske-type [2Fe-2S] cluster and one Fe(II) ion per ? subunit, which were
identified by their characteristic EPR signature. The enzyme showed an exceptionally broad
substrate specificity, as it could hydroxylate a wide range of PAHs made of two to five fused
rings, including the carcinogens, benz[a]anthracene and benzo[a]pyrene. With naphthalene as
substrate, steady-state kinetics showed that the enzyme had a low apparent Km (0.92 WM) and
a specificity constant of 2.0 WM-1. s-1. The Phn1 protein was crystallized and its threedimensional
structure was determined at 1.85 A resolution. In spite of moderate sequence
similarity with homologous dioxygenases, the 3D polypeptide fold was found to be very
similar, most of the differences being observed near the substrate binding pocket.
Many protein crystals, especially those of Fe-S proteins, have been shown to undergo
X-ray radiation damage, leading to artifacts in protein structure determinations. As an attempt
to solve the problem, ultra-high energy X-rays (55 keV; 0.22 A), which are only slightly
absorbed by proteins, were used for the first time to determine the 3D structure of a model
protein, lysozyme. Beamline specificities as well as optimum energy were determined.
Potential applications for structural biology are discussed.
metalloproteins – ferredoxin – iron-sulfur cluster – dioxygenase – hydrocarbonbiodegradation – synchrotron radiation – X-ray crystallography.