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Fiche détaillée Thèses
Université Joseph-Fourier - Grenoble I (25/02/2005), Danielle Dhouailly (Dir.)
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FACTEURS IMPLIQUES DANS LA DIFFERENCIATION ET LA TRANSDIFFERENCIATION DE L'EPITHELIUM CORNEEN
Ying Yang1

Plusieurs questions concernant les mécanismes de différenciation de l'épithélium cornéen ont été abordées: premièrement, le cristallin est-il réellement l'inducteur de la cornée? La kératine 12 (K12) est-elle spécifique de l'épithélium cornéen ou bien est-elle exprimée aussi dans d'autres épithélia? Enfin, quels sont les rôles respectifs du gène Pax6, le chef d'orchestre de la morphogenèse oculaire et des messages qui pourraient être transmis par le stroma cornéen?
Chez l'embryon de poulet de 2/3 jours, Pax6 est exprimé dans les noyaux non seulement des futurs tissus oculaires, mais aussi dans le cerveau, ainsi que dans l'épithélium nasal et oral. Après l'individualisation de la cornée, Pax6 continue d'être exprimé tout au long de la vie non seulement embryonnaire, mais aussi de la vie adulte. Par contre, l'expression de Pax6 est éteinte après 7 jours d'incubation dans l'épithélium nasal et oral.
L'expression de K12, marqueur de différenciation de l'épithélium est facilement observable seulement à partir d'un stade embryonnaire relativement avancé : 14 jours d'incubation pour le poulet, 21 jours de gestation pour le lapin, et tout au long de la vie adulte. Cette expression est spécifique de l'épithélium cornéen.
J'ai transfecté le cDNA codant pour une forme active de Pax6 (couplée à l'activateur VP16) chez l'embryon de poulet de 2.5 à 3 jours d'incubation, par la technique d'électroporation in ovo. Le résultat est une orientation dorso/ventrale anormale de l'œil, montrant l'importance d'une régulation fine et précise de la quantité et de la localisation de la protéine Pax6. Cependant aucune formation ectopique de tissus oculaires n'en a résulté.
J'ai étudié le rôle du cristallin, présenté comme l'inducteur de la cornée. Contrairement à ce qui a été publié antérieurement, celui-ci est seulement requis pour la croissance de l'œil mais ni pour la migration des fibroblastes formant le stroma de la cornée, ni pour l'expression de K12 dans son épithélium.
Afin d'étudier la question du rôle éventuel du stroma lors de l'activation des gènes Pax6, puis K12, j'ai réalisé plusieur types de recombinaisons épithélio/mésenchymateuses. Les recombinants ont été greffés sous la capsule du rein de souris athymique. Les expériences réalisées avec les tissus d'embryon de poulet montrent que Pax6 peut être éteint et le futur épithelium cornéen transformé en épiderme et en plumes seulement avant 5 jours d'incubation. En collaboration avec le Dr. David Pearton, nous avons montré que au contraire chez les mammifères, Pax6 peut être éteint et la formation d'un épiderme et de follicules pileux obtenus même à partir d'un épithélium cornéen prélevé chez l'adulte.
L'insuffisance du nombre de donneurs pour les greffes de cornée est un challenge. Nous nous sommes donc demandés si la transformation inverse de divers épithéliums en épithélium cornéen ètait réalisable. Ni l'association avec un stroma cornéen, ni la transfection de Pax6 n'a permis d'obtenir ce résultat.
1 :  LEDAC - Laboratoire d'études de la différenciation et de l'adhérence cellulaires
poulet – cornée – interactions épithélio-mésenchymateuses – K12 – cristallin – Pax6 – lapin – transdifférenciation – peau.

FACTORS INVOLVED IN CORNEAL EPITHELIUM DIFFERENTIATION AND TRANSDIFFERENTIATION
General questions about mechanisms in differentiation of corneal epithelium are experimentally addressed: Is the lens required for its induction? Is keratin12 (K12), which is considered to be a cornea-specific keratin, also expressed in other tissues except cornea? What are the respective roles of the eye master gene Pax6, versus other genes coding for diffusible proteins in the corneal stroma?
In early chick embryos, Pax6 is expressed in the nuclei not only in the developing eye tissues, but also in other head epithelia such as nasal and oral epithelia. After corneal epithelium individualization, Pax6 continues to be expressed through all the embryonic stage and the life of the adult, whereas it is downregulated until no more expressed after 7 days of incubation in the other head epithelia. K12 expression is strongly detectable in the cytoplasm of the corneal epithelium from a late embryonic stage, 14 days in chick, 21 days in rabbit, and throughout all the life of the adult. However, no matter of the species, there is no K12 expression detected in the nasal and oral epithelia.
I transfected cDNA coding for an active form of Pax6 (coupled to the VP16 activator) into 2.5 to 3 day chick embryos by in ovo electroporation. This leads to abnormal orientation of the pre-existing developing eye showing the importance of the amount and distribution of Pax6 transcripts, but not to the formation of ectopic eye structure.
I examined the role of the lens in the differentiation of the corneal epithelium by removing the invaginating lens vesicle in chick embryo. In contrast to what has been previously published, we find that the lens is required only for the general growth of the eye, but not for cornea differentiation, neither stromal fibroblasts migration, nor epithelial K12 expression.
To address the question whether the stroma plays a role in Pax6 and subsequently K12 expression, I performed several types of epithelial / mesenchymal recombinations. The recombinants were grafted under the kidney capsule of nude mice. Experiments performed with avian tissues showed that Pax6 can be downregulated and chick corneal epithelium directly transformed into an epidermis and subsequently form feathers when associated to a dermis, but only before 5 days of development. In collaboration with Dr. David Pearton, we showed that in contrast, in mammals, Pax6 can be downregulated even in an adult corneal epithelium. Moreover, in the latter case, its transdifferentiation into an epidermis is undirect and process via the formation of epidermal appendages, i.e. hairs.
Because there are insufficient donor for cornea grafting, it was important to know whether a reverse transformation was possible. Initially using chick embryo, I associated corneal stroma with mouth and nasal epithelia, or dorsal epidermis, or Pax6 electroporated epidermis and I found that corneal stroma can not transform these embryonic epithelia into corneal epithelium even after Pax6 electroporation.
chick – cornea – epithelial-mesenchymal interactions – K12 – lens – Pax6 – rabbit – transdifferentiation – skin.