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Université Joseph-Fourier - Grenoble I (17/10/2008), Ina Attrée (Dir.)
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Interactome des antigènes protecteurs V de Pseudomonas aeruginosa et de Yersinia pestis : Mécanisme d'assemblage et interaction avec l'aiguille de sécrétion de type III
Caroline Gebus1, Ina Attree1

Pseudomonas aeruginosa et Yersinia pestis sont responsables d'infections graves chez les individus immunodéprimés et de la peste, respectivement. Leur pathogénicité repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le système de sécrétion de type III (SST3) qui a une action prépondérante lors d'infections aiguës. Le SST3 est composé d'une base ancrée dans la double membrane bactérienne, d'une aiguille creuse érigée à la surface et d'un pore de translocation inséré dans la membrane de la cellule hôte permettant à la bactérie d'y injecter des toxines. L'objet de cette thèse est l'étude de l'interactome de l'antigène protecteur V, PcrV chez P. aeruginosa et LcrV chez Y. pestis. Celui-ci est situé au sommet de l'aiguille et est nécessaire au processus de translocation des toxines. L'étude des propriétés biochimiques de la protéine in vitro nous a permis de mettre en évidence sa capacité à former des oligomères présentant une structure en forme d'anneaux. Les multimères ont été observés par chromatographie d'exclusion de taille, gel natif, spectrométrie de masse native et MET. Leur formation est dépendante de la présence de l'hélice α12 C terminale de PcrV et de l'intégrité de ses résidus hydrophobes. Le processus d'assemblage de la protéine est nécessaire à sa fonction in vivo : des mutants qui sont incapables d'oligomériser perdent leur cytotoxicité envers les cellules eucaryotes.
Puis, l'interaction directe entre PcrV et la sous unité formant l'aiguille, PscF, a été mise en évidence in vitro par co-purification. De plus, deux mutants ponctuels de PscF dont le phénotype présente un défaut de translocation se sont montrés défectueux pour la liaison avec PcrV. Enfin, l'hélice C terminale de PscF est échangeable avec l'hélice α12 C terminale de PcrV comme l'atteste la capacité de polymérisation d'un hybride créé entre ces deux protéines, suggérant un rôle de celle-ci dans la formation du complexe F-V. L'ensemble de ces études montre que l'assemblage multimérique des antigènes V ainsi que leur position au sommet de l'aiguille sont des éléments essentiels à leur fonction, avec un rôle prépondérant de l'hélice α12 C terminale de PcrV. Ces conclusions pourraient permettre de mieux cibler les développements futurs de nouveaux vaccins ou agents antimicrobiens.
1:  BBSI - Biochimie et biophysique des systèmes intégrés
P. aeruginosa – Y. pestis – facteur de virulence – SST3 – Antigènes V (PcrV – LcrV) – oligomérisation – assemblage – injectisome – cible thérapeutique

Protective V antigens of Pseudomonas aeruginosa and Yersinia pestis : Assembly and interaction with type III secretion needle
Pseudomonas aeruginosa can cause severe infections in immunocompromised patients, and Yersinia pestis is the causative agent of plague. During acute infections both bacteria rely on numerous virulence factors including a common type III secretion system (T3SS). T3SS is composed of a basal body anchored in the bacterial bilayer membrane and a hollow needle assembled at the cell surface. The effector molecules are directly injected into the target cells via a translocation pore inserted into the host cell membrane. The aim of this study is to determine the interactome of the protective V antigens PcrV in P. aeruginosa and LcrV in Y. pestis. Both are localised at the tip of type III needles being essential for the translocation process. Biochemical studies in vitro showed that V proteins are able to form oligomeric ring like structures which were characterised by size exclusion chromatography, native gel, native mass spectrometry and TEM. Moreover, the multimerization depends on the hydrophobic residues within the α12 C terminal helix. The fact that the strains expressing the mutant proteins incapable to oligomerize are non-cytotoxic toward macrophages supports the idea that oligomerization is required for the proper function of the V antigens.
Next, direct interaction between PcrV and the needle forming subunit, PscF, was demonstrated by co-purification in vitro. Moreover, two PscF mutants exhibiting a translocation defect were shown as being incapable to form a stable translocation complex. Last, the fact that the C terminal α helix of PscF can be exchanged by the C terminal α helix of PcrV resulting in an hybrid protein that can polymerise, suggests that this helix may be necessary for the complex formation. Taken together, these studies show that the assembly of the multimeric V proteins as well as their tip location are essential for their functions with the α12 C terminal helix of PcrV playing a major role. These conclusions could be of great importance for the future development of new vaccines and antimicrobials.
P. aeruginosa – Y. pestis – virulence factor – T3SS – V antigens (PcrV – LcrV) – oligomerisation – assembly – injectisome – therapeutic target