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Fiche détaillée Thèses
Université Joseph-Fourier - Grenoble I (2009-12-22), Vincent Leroy (Dir.)
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Paramètres immunologiques dans les hépatites virales chroniques: évaluation des réponses lymphocytaires spécifiques CD4+ et CD8+ au cours de l'hépatite virale chronique C
Xavier Camous1

L'hépatite virale C est une maladie touchant aujourd'hui aux alentours de 200 millions de personnes dans le monde. C'est la première cause mondiale de greffe hépatique puisque son issue peut être le développement d'un hépatocarcinome. La maladie se déroule en 2 phases, une aigue, asymptomatique, dont environ 30% des maladies guérissent spontanément. Les autres vont voir leur maladie devenir chronique, avec installation d'une fibrose, puis d'une cirrhose et enfin un risque de 3% supplémentaires par an de développer un cancer du foie. Il n'existe à ce jour aucun vaccin préventif. Le traitement standard utilisé est une combinaison d'interféron alpha pégylé et de ribavirine et n'est efficace que dans 50% des cas pour le génotype 1, majoritaire. A ce jour, les mécanismes d'action du traitement lors de la phase chroniques sont très flous. Les objectifs de ce travail ont été d'étudier un panel varié de populations cellulaires périphériques et intrahépatiques au cours de l'hépatite C chronique afin notamment d'en évaluer les impacts causés par le traitement. Nous avons étudié finement les populations de cellules NK qui sont connues pour avoir certainement un rôle important dans la pathologie ainsi que pour subir de lourdes pressions du virus. Nous avons aussi étudié des facteurs immunitaires avant traitement potentiellement capables de nous indiquer quels malades répondront favorablement à la thérapie et quelles cellules produisaient de l'IFN en phase prétraitement. Nous avons étudié une multitude de paramètres immunologiques durant toutes les phases d'un traitement, avant pendant et 6, mois après, afin de pouvoir conclure sur les effets immunologiques de la bithérapie IFN+ribavirine. Enfin nous avons voulu caractériser et élucider la localisation et les rôles exacts des cellules T régulatrices périphériques et intrahépatiques au cours de l'hépatite C. Afin d'atteindre les buts que nous nous étions fixé, nous avons utilisé une assez vaste combinaison de technologies. Nous avons étudié les phénotypes des cellules par cytométrie de flux en 4 couleurs, mesuré l'expression d'une grande variété de gènes d'intérêts par RT-PCR, mesuré la sécrétion d'IFN spécifique du virus par elispot et enfin la sécrétion d'un panel de 6 cytokines de profil Th1 par CBA. Nous avons travaillé en étroite collaboration avec le département d'hépatogastroentérologie du CHU de Grenoble qui nous a fourni les échantillons sanguins et les biopsies hépatiques dont nous avions besoin. Nous avons tout d'abord étudié les populations NK intrahépatiques et périphériques ainsi que les corrélations entre leurs fréquences, leur phénotype et les paramètres cliniques. Cette étude a été réalise sur des malades chroniques d'hépatite C, mais aussi des témoins sains et atteints d'hépatite B chronique afin d'en extraire les impacts virus-spécifiques. Nous avons trouvé une augmentation du ratio NK cytotoxiques/NK sécrétrices lors de l'hépatite virale C. Nous avons pu mettre en lumière 2 sous-population particulières de NK, l'une associées au contrôle du virus, CD3-CD56dimNKG2A+, et l'autre a contrario associée aux lésions hépatiques, CD3-CD56brightNKG23A+. Notre étude sur les facteurs prétraitement prédictifs de la réponse thérapeutique a permis de déterminer le taux basal d'expression de l'IFN comme étant corrélé positivement à la réponse au traitement. De plus, il est significativement plus élevé chez les malades chroniques que chez les contrôles sains. Nous avons voulu ensuite savoir dans quel type cellulaire il était exprimé chez les futurs répondeurs. Nous en avons conclu que les cellules productrices d'IFN avant thérapie étaient les lymphocytes TNK. Nous avons ensuite suivi la réponse immunitaire T au cours du traitement contre l'hépatite C. Nous avons mesuré l'activation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ via l'expression du récepteur CD25 (IL-2R), leur sécrétion d'interféron  en présence de peptides viraux par le biais de la technique de l'elispot, l'expression des gènes antiviraux induits par les IFNs par RT-PCR et les évolutions de leur phénotype, en plus de celui des cellules NK, par cytométrie en flux. Pour se faire, nous avons eut accès à une cohorte de malades issus d'un essai clinique financé par l'ANRS en collaboration avec le département d'hépatogastroentérologie du CHU de Grenoble, le projet Gammatri. Celui-ci consistait en l'évaluation de l'impact de l'ajout d'interféron  en injection pour des patients non-répondeurs à la thérapie classique. Nous avons pu avoir des prélèvements sanguins réguliers des malades avant, pendant les 48 semaines de traitement et après un suivi à la semaine 72, d'où nous avons extrait les cellules mononuclées. Nous avons déduits de cette étude que le traitement n'augmentait pas ni n'améliorait la réponse immunitaire spécifiques au VHC. Au contraire, il semble l'annuler, certainement pour laisser le temps à d'éventuels mécanismes indépendants des cellules de l'immunité adaptative de se mettre en fonctions. Nous avons également mis au point un système de culture de lymphocytes en présence de protéines virales permettant de mesurer l'impact direct de molécules sur la réponse spécifique au virus. Ce système a été utilisé sur des cellules de malades non traités, mises en présence d'IFN et de ribavirine à des doses proches des doses reçues in vivo lors du traitement par les cellules intrahépatiques. Dans ce cadre là, les techniques de PCR, de cytométrie en flux et d'elispot nous ont permis d'observer les modifications cellulaires induites par les molécules ajoutées. En étudiant les effets de l'interféron  et de la ribavirine sur les cellules T CD4+ et CD8+ et les cellules NK et TNK. Nous avons pu montrer que le traitement régulait négativement toutes les populations cellulaires testées à l'exception des cellules TNK, et ce seulement aux tout débuts de la culture. Enfin, nous avons étudié les lymphocytes T régulateurs (TReg) pour déterminer leur localisation et leurs rôles durant la maladie. Il s'est avéré que les TReg n'influençaient pas la charge virale, donc à priori n'inhibaient pas les cellules effectrices spécifiques du virus. En revanche, ils sont colocalisés dans les infiltrats hépatiques CD8+ et participent à la protection du foie des lésions en inhibant les cellules cytotoxiques par contact direct. Ceci ne dure néanmoins pas très longtemps puisqu'au-delà d'un certaine état de fibrose (>Metavir A2/F3), les TReg n'ont plus aucun contrôle sur les lésions hépatique, ce qui pourrait être l'une des causes de l'apparition de la cirrhose. Pour conclure, l'influence du virus sur l'immunité de son hôte est extrêmement complexe et fait intervenir un très grand nombre de facteurs. De notre étude, il en est ressorti que les cellules ayant le plus de potentiel dans le contrôle du virus, et donc devraient être prioritairement ciblées par les futures thérapies, sont les cellules NK CD3-CD56dimNKG2A+, corrélées négativement avec la charge virale, et les lymphocytes TNK, étant les seuls à répondre positivement à la thérapie par une sécrétion d'IFN. De plus, il serait nécessaire d'entretenir l'activité des cellules TReg intrahépatiques au-delà du stade A2/F3 pour empêcher la formation de lésions cirrhotiques menant au cancer du foie. Enfin, la mesure du taux d'expression de l'IFN avant traitement pourrait être un bon prédicateur de la réponse thérapeutique et ainsi permettre de mieux prendre en charge les malades.
1 :  Institut d'oncologie/développement Albert Bonniot de Grenoble
immunologie – lymphocytes – biologie cellulaire – hépatite – virologie

Immunological parameters in chronic viral hepatitis: evaluation of CD4+ and CD8+ specific T cells response during chronic viral hepatitis C.
About 200 million people are infected by hepatitis C virus worldwide. As the outcome of the disease may be hepatocellular carcinoma, it is the main cause of liver transplantations in the world. When you are infected by HCV, you are in the acute phase of the disease. It's generally asymptomatic and approximately 30% of infected patients resolve the infection spontaneously. Others will become HCV chronic carriers and may develop fibrosis which may evolute in cirrhosis. At this stage, there is an additional 3% per year risk to develop hepatocellular carcinoma. There is still no preventive vaccine. The standard therapy is a combination of pegylated IFN and ribavirin and is only effective in 50% cases of genotype 1 infected patients. Nowadays, we still don't know clearly how this therapy works during chronic phase. The objectives of this work were to study a various panel of cell populations, in peripheral blood and in the liver, during chronic hepatitis C to evaluate treatment impacts on these. We finely characterized the populations of NK cells, which are known to potentially play an important role during the disease and to undergo heavy viral pressures. We also studied predictive immunological parameters able to indicate to clinicians which patients develop a sustained virological response and what cell populations product IFN before treatment. We have studied a variety of immunological parameters before, during, under and 6 months after a hepatitis C therapy to try to conclude on immunological impact of combination IFN and ribavirin. Finally, we decided to characterize and localize intrahepatic and peripheral TReg during hepatitis C. To achieve our goals, we used a wide range of technologies. We studied cellular phenotype by 4-colors flow cytometry, measured gene of interest expression by RT-PCR, quantified IFN secretion against HCV proteins by elispot and dosed cytokines secreted against HCV peptides by CBA. We worked in collaboration with the "département d'hépatogastroentérologie du CHU de Grenoble " which supplied blood samples and liver biopsies we needed. We first studied peripheral and intrahepatic NK cells population as well as correlations between their phenotype, frequencies and clinical parameters in chronic hepatitis C patients. We used healthy and hepatitis B controls. We found an increase of the of the cytotoxic/secretive NK cells ratio during hepatitis C. Two particular populations of NK cells were identified. One correlated to viral control, CD3-CD56dimNKG2A+, and the other with hepatic lesions, CD3-CD56brightNKG23A+. Our study on pretreatment predictive immunological parameters found that basal expression of IFN is positively correlated to a sustained virological response. Moreover, this expression is significatively higher in chronical HCV carriers compared to healthy controls. Then, we investigated the type of cells producing IFN and we found that it was TNK cells. Following this, we monitored T cells response during therapy. We evaluated the activation of CD4+ and CD8+ T cells through CD25 (IL-2R) expression, their IFN secretion against HCV peptides with elispot, ISG expression using RT-PCR and the evolutions of their phenotype, including NK's and TNK's, by flow cytometry. Biological sample were obtained from a clinical trial funded by ANRS in collaboration with the hepato-gastroenterology department at the Grenoble hospital, Gammatri project. This consisted of adding IFN to the classical therapy to improve its response rate. We have had regular blood samples before, during and 6 months after the end of therapy. Our results showed that therapy didn't improve the response of HCV specific T cells neither increased it. In contrast, it rather suppressed T cells response, maybe to let T cells- independent mechanisms work. We also developed an in vitro culture system with HCV proteins which let us measure the direct impact of molecules on the subpopulations of HCV specific T cells. We used it with PBMC from non treated patients cultured with physiological doses of IFNand ribavirin. The only population responding positively to treatment by secreting IFN was TNK and only during the very first hours in culture. Finally, we studied the regulatory T cell (TReg) to determine their location and roles during the disease. We didn't found any correlation between TReg frequencies and viral load, so it seems that TReg didn't inhibit HCV specific T cells. They are colocalized in CD8 infiltrates and may participate in hepatic preservation by inhibiting cytotoxic cells by direct contact. This protective effect only lasts until fibrosis reach the A2/F3 grade. Beyond, TReg lose their effect and this fact may be a cause of the onset of cirrhosis. To conclude, the influence of virus on the immunity of its host is extremely complex and involves a larger number of factors. In our study, we showed that cells with the better potential in virus control were CD3-CD56dimNKG2A+ NK cells, negatively correlated with viral load, and TNK, responding positively to therapy. It is necessary to study in details for the developments of the immunotherapy in the future. Moreover, it will be interesting to maintain TReg activity beyond A2/F3 grade to prevent the formation of cirrhotic lesions. The measure of IFN expression before the treatment may be a good predicator of sustained viral response and provide better care for patients.
immunology – lymphocytes – cellular biology – hepatitis – virology