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Université Pierre et Marie Curie - Paris VI (26/05/2005), Ulrich Bockelmann (Dir.)
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Détection de l'hybridation de l'ADN sur réseaux de transistors à effet de champ avec fixation polylysine
Cédric Gentil1

Ce manuscrit présente l'étude d'une nouvelle méthode de détection électronique différentielle de l'hybridation entre nucléotides, utilisant des réseaux de transistors à effet de champ et une fixation des ADN sondes de type polylysine. Les structures employées sont des réseaux d'EOSFETs, possédant une interface du type électrolyte/oxyde/semi-conducteur (EOS), qui peuvent être immergés dans un électrolyte de mesure dans lequel est plongée une électrode de référence.
La première partie de ce travail détaille les expériences nous ayant permis de montrer le faisabilité d'une détection électronique d'abord de polylysine, puis d'ADN sur une réseau d'EOSFETs. Des micro- ou macro-gouttelettes de solutions contenant ces bio-polymères chargés ont été déposées en des endroits prédéfinis sur les réseaux de capteurs. Ces dépots locaux induisent des variations des caractéristiques courant-tension des transistors exposés, pouvant être corrélées à un apport de charges soit positives dans le cas de la polylysine, soit négatives en ce qui concerne l'ADN. Le signal électronique est proportionnel au nombre moyen d'oligonucléotides de 20 bases par unité de surface, tant que celui-ci reste inférieur à 1000-10000 molécules par µm², avec une variation de 10 mV pour 100 à 1000 molécules déposées par µm². Une saturation du signal électronique est observée au delà. La détection de micro-dépots de faibles concentrations en bio-polymères est limitée par l'existence de signaux électroniques parasites observés avec des solutions servant aux dilutions. La variations des signaux électroniques en fonction de la concentration en sel a également été caractérisée.
L'utilisation d'un protocole d'hybridation sur fixation polylysine, sans étape de blocage visant à limiter l'adsorption non spécifique de cibles a conduit à la mise en évidence d'un signal différentiel de l'ordre de 5 mV lors d'hybridations et de mesures dans un électrolyte de KCl 20 mM. L'hybridation à haut sel et la détection à bas sel permettent d'obtenir des différences d'environ 15 mV. Aucun signal électronique significatif d'appariement n'a été observé en utilisant un bloqueur. La sensibilité de détection électronique de l'hybridation, estimée à 100-1000 double-brins de 20 paires de bases par µm² est proche de celle associée à la technique classique de fluorescence (0,5 à 80 double-brins par µm²).
1:  LPA - Laboratoire Pierre Aigrain
hybridation – détection électronique différentielle – transistor à effet de champ – polylysine – ADN

A new approach aiming at detecting electronically and in a differential mode DNA hybridization using polylysine fixation of the probes, has been developed. The measurements were performed with integrated arrays of EOSFET structures covered with an electrolyte. This type of semiconductor structures is operating with a reference electrode and is characterized by electrolyte-oxide-semiconductor (EOS) interfaces. The electronic detection of two charged biopolymers, polylysine and DNA, has been investigated. Local spotting of these biomolecules solutions onto the array, induces sizeable variations in the DC current-voltage characteristics of the transistors exposed to the molecular charges. The variation of the DC characteristics due to the adsorption of polylysine or DNA showed opposite effects and can be correlated to a contribution of positive charges for polylysine and negative charges for DNA. For oligonucleotides surface densities lower than 1000-10000 molecules per µm², the electronic signal detected increases linearly, with a variation of 10 mV for 1000-10000 molecules spotted per µm². Above this limit, a saturation of the electronic signal appears. A modeling of the interface charge screening by the electrolyte may account for the reductions in the electronic signals observed when the electrolyte salt molarity is gradually increased. A hybridization protocol without blocking step, aiming at limiting non specific adsorption of target, showed a differential electronic signal of 5 mV, measured with a KCl electrolyte at 20 mM, and of 15 mV at [KCl]=0.01 mM. The sensitivity of this hybridization system (100-1000 double stranded DNA molecules per µm²) is closed to the fluorescence detection sensitivity (0.5-80 double stranded DNA molecules per µm²).
hybridization – differential electronic detection – field effect transistor – EOSFET arrays – polylysine – DNA