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Fiche détaillée Thèses
École normale supérieure de Cachan - ENS Cachan (04/12/2008), Éric Deprez (Dir.)
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Étude des paramètres structuraux et cinétiques caractérisant les interactions intégrases rétrovirales / ADN et l'étape de 3'-processing
Kévin Carayon1

L'intégration de l'ADN viral dans le génome des cellules hôtes est une étape obligatoire du cycle de réplication des rétrovirus. L'intégrase (IN) catalyse le processus global d'intégration en deux étapes distinctes et consécutives. La première des deux réactions, le 3'-processing, consiste en une coupure spécifique d'un dinucléotide au niveau des deux extrémités 3'-OH de l'ADN viral. L'IN transfère ensuite de manière concertée ces deux extrémités au sein de l'ADN cible. Nous avons, par des techniques basées sur l'anisotropie de fluorescence, caractérisé les paramètres structuraux et cinétiques du 3'-processing catalysé par l'IN du VIH-1. Nous avons montré d'une part que cette activité dépend de la taille des complexes IN / ADN. Nous avons trouvé que le dimère d'IN est la forme multimérique la plus active tandis que les complexes de haut poids moléculaire sont relativement peu efficaces. D'autre part, la structuration du domaine N-ter joue un rôle clé dans l'assemblage coopératif de ce dimère en présence de Mg2+ comme cofacteur cationique. Ce rôle n'est pas essentiel en présence de Mn2+. L'étude de l'IN de PFV-1, un spumavirus, plus soluble, nous a permis de mettre en évidence une reconnaissance préférentielle de l'extrémité processée de l'ADN viral par cette IN, cette propriété n'avait jamais été observée pour l'IN du VIH-1 car elle était masquée par sa propension à l'agrégation. Nous avons également montré que ces deux IN rétrovirales réalisent le 3'-processing suivant un mécanisme catalytique lent de type « single turn-over ».
1 :  LBPA - Laboratoire de Biotechnologie et Pharmacologie génétique Appliquée
intégrase – VIH-1 – interaction protéine / ADN – anisotropie de fluorescence – enzymologie – PFV-1 – biochimie des protéines – pharmacologie

Study of kinetics and structurals parameters of retroviral integrase / ADN interactions and the 3'-processing step
The integration of the retroviral DNA into the host genome is a key process in the retroviruses life cycle. Integrase (IN) catalyzes two distinct and consecutive steps that constitute the overall integration process. The first of these two reactions is 3'-processing which corresponds to the specific cleavage of two nucleotides from each 3'OH-end of the linear viral DNA. Then, IN transfers both extremities into the target DNA, resulting in full-site integration. Using fluorescence anisotropy based assay, structural and kinetic parameters of the 3'-processing reaction catalysed by HIV-1 IN were characterized. We found that the activity was dependent on the molecular size of IN / DNA complexes. Large complexes were found to be relatively inefficient while the IN dimer was found to be the most active multimeric form. Moreover we found that the structural N-terminal domain rearrangement plays a key role for the cooperative DNA-binding mode of the IN dimer with Mg2+ as the cationic cofactor, but not with Mn2+. In addition, a preferential interaction of IN with processed extremity of viral DNA interaction was clearly demonstrated for spumavirus PFV-1 IN, a more soluble IN; this property has never been observed for HIV-1 retroviral IN because of its aggregation propensity. For both retroviral IN, the 3'-processing reaction corresponds to a slow “single turn-over” mechanism.
integrase – HIV-1 – fluorescence anisotropy – PFV-1 – pharmacology