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Ecole Normale Supérieure de Paris - ENS Paris (06/07/2009), Dr. Chris Bowler (Dir.)
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“Transcriptional and Epigenetic regulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum”
Florian Maumus1

Les océans couvrent plus de 70% de la surface de la Terre (planète bleue) et la productivité primaire nette (PPN) marine est équivalente à celle terrestre. Alors qu‟il ne représente que 1% de la biomasse totale d‟organismes photosynthétiques de la planète, le phytoplancton est responsable d‟environ 45% de la PPN globale. Le terme phytoplancton décrit un assemblage polyphylétique comprenant des eucaryotes et procaryotes photosynthétiques dérivant avec les courants. Dans les océans contemporains, les diatomées constituent un groupe d‟eucaryotes unicellulaires autotrophes très abondant, responsable de 40% de la PPN marine. Les diatomées appartiennent à la lignée des straménopiles qui sont issus d‟un évènement d‟endosymbiose entre une algue rouge et un hôte hétérotrophe. Elles sont classifiées en deux groupes majeurs : les centriques qui son apparues il y a environ 200 millions d‟années (Ma), et les pennées qui ont évolué il y a environ 90 Ma. Deux génomes de diatomées ont récemment été séquencés : celui de la diatomée centrique Thalassiosira pseudonana (32 Mb), et celui de la diatomée pennée Phaeodactylum tricornutum (27 Mb). Mon sujet de doctorat s‟est focalisé sur l‟étude de différents aspects de la régulation de l‟expression génique ainsi que sur la dynamique et l‟évolution de ces génomes. L‟expression des gènes est régulée à différents niveaux: trancriptionel, post-transcriptionel, et épigénétique. Dans le cadre de mon doctorat, une étude de la régulation transcriptionelle chez les diatomées a été effectuée et comprend l‟identification et l‟analyse in silico des facteurs de transcription (FT). Cela a permis par exemple d‟établir qu‟une classe spécifique de FT, les Heat Shock Factors, sont particulièrement abondants chez les diatomées par rapport aux autres eucaryotes. L‟analyse de la représentation des FT identifiés dans différentes librairies d‟EST élaborées à partir de cultures ayant subi divers stress a permis de détecter certaines spécificités d‟expression. L‟évolution des génomes eucaryotes est largement impactée par les effets directs et secondaires des éléments transposables (ET) qui sont des éléments génétiques mobiles se trouvant dans le génome de la plupart des organismes. Dans le but d‟étudier la dynamique des génomes de diatomées, la recherche de différents types d‟ET a permis d‟établir qu‟une certaine classe, les rétrotransposons de type Copia, est la plus abondante dans ces génomes et constitue un part significativement plus importante du génome de P. tricornutum (5,8%) par rapport à T. pseudonana (1%). D‟autre part, des analyses phylogénitiques ont montré que les rétrotransposons de type copia forment deux classes distinctes et éloignées de la lignée Copia. L‟analyse de leurs niveaux d‟expression a montré que la transcription de deux éléments s‟active en réponse à des stress spécifiques comme la limitation en nitrate dans le milieu de culture. Cette activation est accompagnée par un hypométhylation de l‟ADN et l‟analyse de profils d‟insertions chez différents écotypes de P. tricornutum ainsi que l‟étude d‟autres phénomènes suggèrent que les rétrotransposons de type Copia ont joué un rôle important dans l‟évolution des diatomées. Mon grand intérêt pour les ET m‟a ensuite amené à chercher à les caractériser dans d‟autres génomes récemment séquencés tels celui de l‟algue brune Ectocarpus siliculosus. La recherche in silico de différents gènes codant des protéines capables d‟introduire ou de stabiliser des états épigénétiques telle que la modification des histones et la méthylation de l‟ADN a montré leur présence chez P. tricornutum ainsi que leurs particularités. La présence de certaines modifications d‟histones spécifiques d‟une conformation compacte ou ouverte de la chromatine dans le proteome de P. tricornutum a été montrée. De plus, la mise au point de la technique d‟immunoprécipitation de la chromatine chez P. tricornutum a permis d‟établir que les nucléosomes enrobés d‟éléments transposables étaient marqués par des modifications spécifiques. D‟autres expériences ont permis d‟établir que l‟ADN de différents types d‟éléments transposables est marqué par la méthylation de cytosines chez P. tricornutum. Une expérience permettant l‟analyse du profil de méthylation à l‟échelle de génome en utilisant une puce à ADN a été lancée et permettra de découvrir si certains gènes portent aussi des traces de méthylation. Enfin, les ARN interférents constituent un troisième mode de régulation de l‟expression se situant à l‟interface de la régulation transcriptionelle, post-transcriptionelle et épigénétique. Les mécanismes d‟interférences chez les diatomées ont été étudié par la recherche in silico d‟enzymes clés impliquées dans ce processus ainsi qu‟en établissant expérimentalement un lien direct avec la méthylation de l‟ADN.
1:  ENS Paris - Ecole Normale Supérieure de Paris
Marine microbiology – comparative genomics – diatoms – chromalveolates – epigenetics – genome dynamics – DNA methylation – Copia elements – Transcriptional regulation

“Transcriptional and Epigenetic regulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum”
The unicellular chlorophyll c-containing algal class Bacillariophyceae (diatoms) is among the most successful and diversified groups of photosynthetic eukaryotes, with possibly over 100,000 extant species (Round et al., 1990) widespread in all kinds of open water masses. The contribution of diatom photosynthesis to marine primary productivity has been estimated to be around 40% (Nelson et al., 1995; Raven and Waite, 2004). Diatoms have a peculiar genetic makeup in that they are likely to have emerged following a secondary endosymbiotic process between a photosynthetic eukaryote, most probably red algal-like, and a heterotrophic eukaryote (Falkowski et al., 2004). They are traditionally divided into two orders: the centric diatoms which are radially symmetrical and are thought to have arisen around 180 Million years ago (Mya), followed by the pennate diatoms around 90 Mya which are bilaterally symmetrical. The complete nuclear, mitochondrial, and plastid genome sequences of the centric diatom Thalassiosira pseudonana (32 Mb) and the pennate diatom Phaeodactylum tricornutum (27 Mb) have recently become available (Armbrust et al., 2004 and Bowler et al., 2008). My PhD focalized on the study of various aspects of the regulation of gene expression in diatoms as well as on the study of genome evolution and dynamics in these species. Gene expression is regulated at the transcriptional, post-transcriptional, and epigenetic (or pre- transcriptional) levels. In the framework of my PhD, I performed an in silico search in diatom genomes for transcription factors (TFs), which are master control proteins involved in transcriptional regulation, in order to get a panorama of the TF complement in these species and to identify lineage-specific peculiarities. We found, for example, that Heat Shock Factors (HSFs) have been amplified dramatically during the course of diatom evolution. Analysis of the abundance of TFs in different P. tricornutum and T. pseudonana-derived EST libraries enabled us to identify some specificities of their expression. The evolution of eukaryotic genomes is impacted by the direct or secondary effects of transposable elements (TEs), which are mobile DNA sequences that inhabit the genomes of most organisms. In order to evaluate genome dynamics in diatoms, the search for transposable elements in diatoms enabled to establish that a specific class of TEs, the Copia-like retrotransposons, is the most abundant in diatom genomes and has been significantly amplified in the P. tricornutum genome with respect to T. pseudonana, constituting 5.8 and 1% of the respective genomes. Phylogenetic analysis enabled me to demonstrate that diatom genomes harbor two classes of diatom-specific Long Terminal Repeat retrotransposons (LTR- RTs), as well as another class which is widespread among eukaryotes. Analysis of their abundance in various P. tricornutum-derived EST libraries has shown that two of these elements are activated in response to stress such as nitrate starvation. This activation is accompanied by DNA hypomethylation and the analysis of insertion profiles of different P. tricornutum ecotypes from around the world as well as other clues suggest that TEs play an important role in the generation of variability in diatom genomes. My interest in TEs further led me to try to characterize them in the genome of the brown alga Ectocarpus siliculosus. In silico searches for genes encoding proteins putatively capable of introducing or stabilizing epigenetic modifications such as histone modifiers and DNA methyltransferase has shown the presence of a large set of such proteins in the P. tricornutum genome, as well as their particularities. The presence of particular histone modifications in the P. tricornutum proteome has also been assessed by western blot experiments. In addition, I adapted a chromatin immunoprecipitation protocol for P. tricornutum which was used successfully to observe that histones within nucleosomes associated with TEs were marked with specific modifications. Other experiments enabled to establish that most TEs are marked by DNA methylation in P. tricornutum. An experiment aiming to obtain genome-wide DNA methylation pattern in this species has been designed and launched and will allow to whether some genes are also methylated. Finally, small RNAs (sRNAs) constitute an additional mode of regulation of gene expression, acting at the interface between transcriptional regulation, post-transcriptional regulation, and epigenetic phenomena. I have studied sRNA-based mechanisms in diatoms by performing an in silico search that showed that proteins putatively involved in the generation of sRNAs are only poorly conserved in diatoms. I was also able to determine experimentally a link between sRNA and DNA methylation in P. tricornutum.
Marine microbiology – comparative genomics – diatoms – chromalveolates – epigenetics – genome dynamics – DNA methylation – Copia elements – Transcriptional regulation