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Université Paris Sud - Paris XI (16/10/2009), Nathalie Westbrook (Dir.)
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Observation de l'activité traductionnelle d'un ribosome unique par microscopie de fluorescence couplée à un système microfluidique
David Dulin1, 2

Dans ce mémoire sont présentées la conception et la réalisation d'une expérience portant sur l'étude en molécule unique de l'activité traductionnelle du ribosome procaryote. Pour ce faire, nous utilisons un ribosome et des acides aminés lysines marqués spécifiquement avec deux marqueurs fluorescents ayant des spectres d'émissions différents. Ainsi, nous pouvons colocaliser les ribosomes et les acides aminés incorporés en utilisant la microscopie de fluorescence par réflexion totale (TIRFM). Pour pouvoir compter les acides aminés incorporés, nous avons réalisé une étude en molécule unique des propriétés photophysiques du fluorophore organique les marquant, le Bodipy FL. Celui-ci a une faible durée de vie et clignote beaucoup. Afin de remédier à ces problèmes, nous avons développé un système permettant d'augmenter sa durée de vie d'un facteur 25 environ, et qui réduit le taux de clignotement pour de faibles intensités d'excitation. L'étude des ribosomes à proximité de la surface d'une lamelle de microscope nous a amenés à développer une chimie de surface n'autorisant qu'une accroche spécifique des espèces biologiques étudiées et conservant l'activité des ribosome. Ces études ont été réalisées à l'aide de cellules microfluidiques élaborées par nos soins permettant une grande flexibilité lors des expériences. Nous avons élaboré un marquage spécifique original du ribosome à l'aide d'un nanocristal semi-conducteur. Nous avons évalué la spécificité de l'accroche ainsi que l'activité du ribosome marqué en mesure d'ensemble. Nous avons ensuite observé l'activité de ces ribosomes marqués accrochés à une surface en molécule unique. Des expériences préliminaires en molécules uniques ont démontré que des ribosomes non marqués étaient capables d'incorporer les acides aminés marqués Bodipy FL . Enfin, nous présentons les premières étapes de conception d'une pince optique pour mesurer des forces de cohésion sur des structures particulières de l'ARN messager.
1:  LCFIO - Laboratoire Charles Fabry de l'Institut d'Optique
2:  ICSN - Institut de Chimie des Substances Naturelles
lcf-oa,bio
molécule unique – microscopie de fluorescence – chimie de surface – photoblanchiment – clignotement – ribosome – traduction – pince optique.

Translation activity of the ribosome studied by single molecule fluorescence microscopy in a microfluidic flow cell
This thesis recounts the conception and the realisation of an experiment about the study at the single molecule level of the prokaryotic ribosome activity. To do that, we use ribosomes and amino acids labeled with two fluorescent probes which emit at two different wavelengths. Thus, we are able to co-localize the ribosomes and the incorporated amino acids by single molecule total internal reflexion fluorescence microscopy. In order to count the number of incorporated amino acids, we studied, at the single molecule level, the photophysical properties of their probe : the organic fluorophore Bodipy FL. We used a buffer containing an oxygen scavenger and two chemical reagents, one oxydising and one reducting, to increase the life-time, by a factor of 25, and the fluorescence stability in reducing the blinking at low laser excitation intensities. For the single molecule ribosome study, we developped a versatile microfluidic cell. The surface chemistry was carefully elaborated to eliminate non specific interactions between the surface and the biological reagents, and to preserve the ribosome activity. We incorporated a specic tag in the ribosome to label it with a semiconductor nanocrystal (QD). The activity of the ribosome labeled with a QD was observed in bulk experiment, then at the single molecule level. The Bodipy FL labeled amino acid incorporation by single ribosomes was also observed. Finally, we present the first steps of the conception of an optical tweezer to determine messenger RNA cohesion forces.
single molecule – fluorescence microscopy – surface chemistry – photobleaching – blinking – ribosome – translation – optical tweezers.