Rational characterization and quantification of Deinococcus geothermalis physiology using nutritional studies
Caractérisation et quantification rationnelles de la physiologie de Deinococcus geothermalis par une approche de génie nutritionnel
Résumé
Bacteria belonging to Deinococcaceae family are microorganisms with exceptional resistance properties to extreme environmental conditions such as ionizing radiations, oxidative stress, dehydration or extreme temperatures. These properties make them interesting targets for biotechnological processes for metabolite production like biofuels. Nevertheless, physiological behaviour and metabolism of these microorganisms have been little studied to date. The main objective of this work was to study the nutritional requirements for the growth of a Deinococcaceae strain, Deinococcus geothermalis, in order to define a synthetic medium sufficient for a non-limiting growth of this strain. The statistical study of 48 culture media formulations highlighted a lot of variability between the compositions used for their growth. A limiting growth of the strain Deinococcus geothermalis DSM 11300 was obtained on the defined medium DM chosen for this work, in Erlenmeyer flasks and in bioreactor, unless yeast extract was added to the medium. Cultivated in a bioreactor at 45 °C, on a complex medium with glucose (CMG), the biomass concentration reached 2.7 gMS.L-1 in six hours with a growth rate of 0.65 h-1. The results showed intra-specie variability; the strain Deinococcus geothermalis DSM 11302 exhibits the best number of generation in both complex and defined media. The study of the influence of inoculum preparation steps allowed standardizing the conditions of inoculum preparation before cultures in bioreactor. The strain Deinococcus geothermalis DSM 11302 has a four hours exponential growth when cultured in bioreactor on the defined medium DM at 45 °C, but the maximal growth rate of 0.28 h-1 decreases rapidly. The yield of biomass production on glucose reached 0.25 gX.gGlc-1 (0.30 CmolX.CmolGlc-1). Oxygen uptake and glucose specific uptake rates were 3.3 mmol.L-1.h-1 and 0.57 CmolGlc.CmolX.h-1 respectively. None of the carbon sources, sulfur sources or growth factors added to the defined medium DM could improve growth results of the strain Deinococcus geothermalis DSM 11302. For the quantification of Deinococcus geothermalis DSM 11302 physiology, a fed batch culture strategy with a yeast extract and glucose co-substrate feed was chosen. This strategy revealed that glucose is not the preferential carbon source for biomass production. In addition, yeast extract can be consumed as organic nitrogen source and/or as carbon source. Deinococcaceae are mainly proteolytic microorganisms, yeast extract is an essential element to obtain a non-limiting growth of Deinococcus geothermalis DSM 11302. With this co substrate feed strategy, 253 g of yeast extract and 26 g of glucose were added to produce 99 gMS of biomass or 9.6 gMS.L-1 in six hours. The maximal yeast extract and glucose specific uptake rate reached respectively 0.68 and 0.39 Cmol.CmolX 1.h 1. The maximal exponential growth rate is 1.05 h-1, which is the best result describes to date for a Deinococcaceae strain. These results implement the knowledge on physiology and nutritional requirements of Deinococcus geothermalis and give access to quantitative values for characteristic kinetic parameters and conversion yields
Les bactéries du genre Deinococcus sont des microorganismes qui présentent des propriétés remarquables de résistance aux conditions extrêmes telles que les radiations ionisantes, les stress oxydatifs, la dessiccation ou encore les températures extrêmes. L’exploitation de leurs capacités présente donc un réel intérêt pour les procédés biotechnologiques de production de métabolites d’intérêt, les biocarburants. Néanmoins, la physiologie et le métabolisme de ces microorganismes ont été très peu étudiés à ce jour. L’objectif de ce travail est d’identifier les exigences nutritionnelles d’une souche de déinocoques, Deinococcus geothermalis, dans le but de définir la composition d’un milieu synthétique permettant une croissance sans limitation. L’étude statistique de quarante huit formulations de milieux de culture a mis en évidence la variabilité qualitative et quantitative des compositions des milieux utilisés pour leur culture. Il ressort que l’ajout de facteurs stimulant la croissance, sous forme d’extrait de levure, est indispensable à la croissance non limitée de la souche Deinococcus geothermalis DSM 11300. En bioréacteur à 45 °C, sur un milieu complexe et substrat glucose, une concentration finale de 2,7 gMS.L-1 a été obtenue en six heures avec un taux de croissance égal à 0,65 h 1. Les résultats ont montré une variabilité intra-espèce importante ; parmi les trois souches de Deinococcus geothermalis étudiées, DSM 11300, DSM 11301 et DSM 11302, la souche Deinococcus geothermalis DSM 11302 présente la meilleure croissance en termes de nombre de générations, en milieu défini ou complexe. L’étude de l’influence des étapes de préparation de l’inoculum a permis de standardiser les conditions de préparation de l’inoculum préalablement aux cultures en bioréacteur. La souche Deinococcus geothermalis DSM 11302 présente une croissance exponentielle durant quatre heures en bioréacteur sur un milieu défini avec 10 g.L-1 de glucose ; le taux de croissance de 0,25 h-1 ne se maintient pas sur une durée plus longue. Le rendement de production de biomasse à partir du glucose atteint 0,25 gX.gGlc-1 soit 0,30 CmolX.CmolGlc-1. L’ajout de sources carbonées, sources soufrées, vitamines ou autres facteurs de croissance ne permet pas d’améliorer la croissance de la souche dans ces conditions. Sur ces bases, la quantification de la physiologie de Deinococcus geothermalis DSM 11302 a été étudiée lors d’une culture en mode discontinu alimenté avec une stratégie d’apport de deux substrats, l’extrait de levure et le glucose. Le mode de conduite a permis de révéler que le glucose n’est pas la source de carbone assimilée préférentiellement et que l’extrait de levure peut être consommé comme source azotée organique et/ou comme source carbonée. Les déinocoques sont caractérisés par un métabolisme principalement protéolytique : il a été possible de confirmer que l’extrait de levure est indispensable à la croissance non limitée de Deinococcus geothermalis DSM 11302. Avec cette stratégie d’alimentation co-substrats, 253 g d’extrait de levure et 26 g de glucose ont été ajoutés pour produire 99 gMS de biomasse soit 9,6 gMS.L-1 en six heures. Les vitesses spécifiques maximales de consommation des substrats, extrait de levure et glucose, atteignent respectivement 0,68 et 0,39 Cmol.CmolX-1.h-1. Le taux de croissance exponentiel maximal obtenu est égal à 1.05 h-1, meilleur résultat décrit à ce jour pour un déinocoque. Ces résultats contribuent ainsi à implémenter l’état des connaissances sur la physiologie et les exigences nutritionnelles de Deinococcus geothermalis et donnent accès aux valeurs de paramètres cinétiques et de rendements, données absentes de la littérature
Origine : Version validée par le jury (STAR)