Development of physico-chemical techniques for the study of biological mechanisms: detection of monoamines released during exocytosis and reactive species of oxygen and nitrogen released during oxidative stress.
Méthodes analytiques pour la détection de phénomènes biologiques de sécrétion à l'échelle de la cellule unique.
Résumé
Excellent spatial and temporal resolution and physico-chemical properties of ultramicroélectrodes (UME) induce high detection sensitivity, thus being particularly well adapted to the study of biological mechanisms of secretion from a single cell. In the " semi-artificial synapse " configuration, the short distance between the transmitting cell and the UME causes appropriate local concentration to be electrochemically detected. UME allows the detection of minute amount of electroactive molecules in real time. This analytical technique was used, completed or adapted to study two major biological phenomena: vesicular exocytosis and cellular oxidative stress. Amperometric investigations of exocytosis, a key mechanism involved in cell communication, allow quantitative monitoring of the kinetics of intravesicular species release into extracellular medium. An UME, placed in the external environment, does not provide any information about vesicles status before fusion. In order to complement this information, we have developed, through microfabrication techniques, a device constituted by conductive and transparent ITO electrodes for combinated detection by amperometry and optical microscopy (TIRFM) for the study of BON BC21 cells secretion. Amperometry at four different constant potentials, used in the laboratory for the detection of ROS/RNS released by macrophages, immune cells, requires a large number of experiments to overcome the cell variability and differences in UME sensitivity. To significantly reduce the experimental duration, we have developed a device constituted by four measuring chambers, each containing a set of three electrodes. These four chambers will allow real time and simultaneous monitoring of changes in production of H2O2, ONOO-, NO* and NO2- by a single cell.
De par leur excellente résolution spatiale et leurs propriétés particulières, les ultramicroélectrodes (UME) constituent des outils de choix pour l'étude de mécanismes biologiques de sécrétion à l'échelle de la cellule unique. En configuration " synapse semi-artificielle ", du fait de la faible distance qui sépare la cellule émettrice de l'UME, les molécules sont libérées dans un faible volume, induisant alors des concentrations suffisamment élevées pour être détectables par électrochimie. Ainsi, les UME offrent la possibiIité de mesurer des flux, même infimes, de molécules électroactives en temps réel. Cette technique analytique a été utilisée, complétée ou adaptée afin d'étudier deux phénomènes biologiques : l'exocytose vésiculaire et le stress oxydant cellulaire. L'analyse ampérométrique de l'exocytose, mécanisme impliqué dans la communication cellulaire, permet l'étude quantitative de la cinétique de libération des molécules intravésiculaires libérées dans le milieu extracellulaire. L'UME, placée dans le milieu extérieur, n'apporte pas d'information quant au statut des vésicules avant la fusion. Pour compléter ces informations, nous avons développé, par des techniques de microfabrication, un microsystème constitué d'électrodes conductrices et transparentes d'ITO permettant un couplage des détections ampérométrique et optique (microscopie TIRF) pour l'étude de la sécrétion des cellules BON BC21. L'ampérométrie à quatre potentiels constants, utilisée au laboratoire pour la détection des ROS/RNS libérées par les macrophages, cellules du système immunitaire, nécessite un grand nombre d'expériences pour s'affranchir de la variabilité cellulaire et des différences de sensibilité des UME. Afin de réduire considérablement le temps d'expérience, nous avons développé un microsystème constitué de quatre chambres de mesure, chacune contenant un jeu de trois électrodes. Ces quatre chambres permettront, à terme, le suivi et la détection simultanée en temps réel des variations de production de H2O2, ONOO-, NO* et NO2- libérées par une cellule.
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