Real-time feedback control of gene expression
Résumé
Gene expression is fundamental for the functioning of cellular processes and is tightly regulated. Inducible promoters allow one to perturb gene expression by changing the expression level of a protein from its physiological level. This is a common tool to decipher the functioning of biological processes: the expression level of a gene is changed and one observes how the perturbed cell behaves differently from an unperturbed cell. A shortcoming of inducible promoters is the difficulty to apply precise and time-varying perturbations. This is due to two reasons: (i) cell-to-cell variability and noise in the gene expression process which limit the precision of the applied perturbations. (ii) the difficulty to quantitatively predict the behavior of cellular systems on a long time-horizon, which would be required to apply time-varying perturbations. But precise time-varying perturbations are particularly informative about the dynamics of a biological system. Here I present a feedback control platform, that can control the expression of a gene in yeast cells with quantitative accuracy over long time periods. The platform integrates fluorescence microscopy to monitor gene expression, microfluidics to act on the cellular environment and software implementing real-time image analysis and feedback control. This closed loop control setup is able to drive the expression of a yeast gene in a population of cells or in a single cell for both time-constant and time-varying target profiles. I use the high osmolarity glycerol (HOG) pathway, a stress response pathway of Saccharomyces cerevisiae, to activate gene expression and I show that the platform can be modified to use other gene induction systems. In addition to the gene expression control platform, I present a feedback control system able to control the activity of the HOG pathway. Understanding cellular dynamics in a quantitative way necessitates the ability of applying precise perturbations. The gene expression control platform that I present here is a major step towards this goal, since it allows to precisely perturb the expression level of a protein.
L'expression génétique est un processus cellulaire fondamental réglé de manière ne. Les promoteurs inducibles perme ent de perturber l'expression génétique en changeant l'expression d'une protéine par rapport à son niveau physiologique de référence. Ce e propriété en fait un outil incontournable pour décrypter le fonctionnement des processus biologiques via la comparaison du comportement de la cellule sous divers niveaux d'induction. Toutefois, une limite actuelle à l'utilisation des promoteurs inducibles provient de la difficulté à appliquer des perturbations précises et dynamiques. Les deux obstacles principaux étant: (i) la variabilité intercellulaire ainsi qu'à la nature aléatoire de l'expression génétique qui limite la précision de la perturbation appliquée. (ii) la difficulté à prèdire quantitativement le comporteement des systèmes biologiques sur les longues periodes requises pour des objectifs d'expression variables dans le temps. Or des perturbations précises et changeant dans le temps perme ent d'obtenir de riches informations sur la dynamique d'un système biologique. Est présenté ici une plate-forme de contrôle temps réel en boucle fermée qui permet le contrôle quantitatif sur une longue durée de l'expression génétique chez la levure. Ce e plateforme utilise la microscopie par uorescence pour suivre l'expression génétique, un système micro uidique pour interagir avec l'environnement cellulaire ainsi qu'un logiciel perme ant l'analyse d'image en temps réel et le calcul de la stratégie de contrôle à appliquer. Ce système permet le contrôle de l'expression d'un gène chez la levure, tant au niveau d'un population cellulaire qu'au niveau de la cellule seule et ceci pour un objectif d'expression constant ou dépendant du temps. Le système de réponse au chocs hyper-osmotiques de la levure S. cerevisiae (HOG pathway) a été utilisé pourin uencer l'expression génétique. Toutefois, la possibilité d'utiliser un autre système d'induction sans profondes modi cations de la plate-forme est démontrée. De surcroît au développement de ce e plate-forme est également ici démontré la possibilité de contrôler le système HOG. A n de comprendre la dynamique cellulaire et de pouvoir la quanti er, il est nécessaire de pouvoir appliquer des perturbations précises. La plate-forme de contrôle de l'expression génétique présentée ici permet de perturber avec précision le niveau d'expression d'une protéine et représente donc une contribution majeure dans ce e direction.