Metabolism and translation of mitochondrial RNA in the yeast S. pombd
Métabolisme et traduction des ARN mitochondriaux chez la levure S. pombe
Résumé
Mitochondria are organelles present in most eukaryotic cells and specialized in the production of energy via the respiratory chain located in their inner membrane. Mitochondria have their own genome and their own system of gene expression, which is involved in the biogenesis of the respiratory complexes. The mitochondrial translation machinery, like the respiratory complexes, has a dual genetic origin, both nuclear and mitochondrial. Numerous human diseases result from defects in the expression of mitochondrial genes and especially mutations of factors involved in mitochondrial translation. The yeast Schizosaccharomyces pombe is a useful model for the identification and functional analysis of these factors because it is a simple organism that is physiologically closer to higher eukaryotes than Saccharomyces cerevisiae. During my PhD I first participated in the development of new tools to further our understanding of mitochondrial translation, by tagging the small and large subunits of S. pombe mitoribosome. In addition I set up fractionation experiments on sucrose gradients to analyze the sedimentation of associated or dissociated mitochondrial ribosomes and test whether given factors are bound to mitoribosome. I also became interested in factors that could act in the termination mitochondrial translation. Surprisingly, the only factor known to recognize stop codons in S. pombe, Mrf1, is not essential, thus I tried to determine which other proteins might also be involved in translation termination. S. pombe contains four predicted peptidyl tRNA hydrolases (Pth), two of which, Pth3 and Pth4, have a GGQ motif like Mrf1, which is thought to contribute directly to the hydrolysis of the peptidyl-tRNA bond. Thus they seemed to be good candidates to explain how S. pombe can survive without Mrf1. I have shown that Pth3 and Pth4 play a role in mitochondrial biogenesis and that Pth4 is both a high copy suppressor and a synthetic lethal of the ∆mrf1 mutant. Finally I worked on the Pentatrico Peptide Repeat family of proteins (PPR), predicted to be involved in the metabolism of mitochondrial RNA. There are at least nine PPR proteins in S. pombe named Ppr1 to Ppr8 and the mitochondrial RNA polymerase, Rpo41. The study of these PPR proteins has shown that all of them are involved in the metabolism of RNA at different stages, mainly stability and translation, and that they often have specific targets. For example Ppr3 is involved in the stability of the small rRNA rns while Ppr4 is a specific activator of the translation of cox1 and Ppr2 is a general activator of mitochondrial translation whose target remains to be identified. Overall, these studies show that S. pombe is an excellent model for mitochondrial functions, both for fundamental studies and as a tool for understanding more complex organisms such as man.
Les mitochondries sont des organites présents dans la plupart des cellules eucaryotes et spécialisés dans la production d'énergie, via la chaîne respiratoire localisée dans leur membrane interne. Les mitochondries possèdent leur propre génome et leur propre système d'expression participant à la biogenèse des complexes respiratoires. En particulier la machinerie de traduction mitochondriale, comme les complexes respiratoires, est d'origine génétique double, nucléaire et mitochondriale. De nombreuses maladies humaines résultent de défauts de l'expression des gènes mitochondriaux et en particulier de mutations de facteurs impliqués dans la traduction mitochondriale. La levure Schizosaccharomyces pombe est un modèle de choix pour identifier ces facteurs et comprendre leur fonctionnement car c'est un micro-organisme simple et physiologiquement plus proche des eucaryotes supérieurs que ne l'est Saccharomyces cerevisiae. Lors de ma thèse j'ai tout d'abord participé à la mise en place de nouveaux outils permettant de mieux comprendre le fonctionnement de la traduction mitochondriale, en étiquetant le mitoribosome de S. pombe au niveau de la petite et de la grande sous-unité. Par la suite j'ai mis au point des expériences de fractionnement sur gradient de saccharose pour analyser la sédimentation du ribosome associé ou dissocié et tester si des facteurs donnés sont liés au mitoribosome. Dans un second temps je me suis intéressé à des facteurs qui pouvaient être impliqués dans la terminaison de la traduction. En fait le seul facteur de reconnaissance des codons stop connu chez S. pombe, Mrf1, n'est pas essentiel, et j'ai cherché à comprendre pourquoi. Deux enzymes, des Peptidyl ARNt hydrolase (Pth) nommées Pth3 et Pth4 possédant toutes deux un motif GGQ comme Mrf1, semblaient être de bons candidats pour expliquer que S. pombe puisse se passer de Mrf1. J'ai montré que ces facteurs jouent un rôle dans la biogenèse mitochondriale et plus précisément que Pth4 est à la fois un suppresseur multicopie et un gène létal synthétique de l'absence de Mrf1. Pour finir j'ai travaillé sur une famille de protéines de S. pombe prédites comme impliquées dans le métabolisme des ARN mitochondriaux : les protéines à Pentatrico Peptide Repeat (PPR). Ainsi il existe au moins 9 protéines PPR chez S. pombe nommée de Ppr1 à Ppr8 ainsi que l'ARN polymérase mitochondriale, Rpo41. L'étude de ces protéines PPR a permis de mettre en évidence qu'elles interviennent toutes dans le métabolisme des ARN à différentes étapes, majoritairement stabilité et traduction, et qu'elles ont souvent des cibles spécifiques. Par exemple la protéine Ppr3 est impliquée dans la stabilité du petit ARNr rns alors que Ppr4 est un activateur spécifique de la traduction de cox1 et que Ppr2 est un activateur général de la traduction mitochondriale dont la cible reste à définir. Globalement, ces travaux montrent que S. pombe est un excellent modèle des fonctions mitochondriales, aussi bien pour les études fondamentales que comme outil pour appréhender les organismes plus complexes comme l'homme.