Development of methods for DNA analysis using cleavage of RNA/DNA chimera and MALTI-TOF mass spectrometry
Développement de méthodes d'analyse de l'ADN par clivage d'une chimère ARN/ADN et par spectrométrie de masse MALDI-TOF
Résumé
As the DNA sequence of the human genome is now completed and available, interest is shifting towards the detection of DNA in candidate genes of human diseases. These DNA modifications can be either in the sequence or epigenetic. Thus, rare, frequent, known and unknown polymorphisms can be identified through development of new methods of sequencing for each individual. We have developed a new method for DNA analysis using cleavage of RNA/DNA chimera and MALDI-TOF MS. The method takes advantage of a novel class of thermostable DNA polymerases that also incorporate ribonucleotides. The RNA/DNA chimera contains three deoxyribonucleotides and the fourth nucleotide in its ribonucleotide form. These products can be either single-stranded linear or double-stranded. The RNA/DNA chimera is cleaved by sodium hydroxide after each ribonucleotide base. All fragments contain only one ribonucleotide 3' terminal base with a phosphate terminal group. Fragments are desalted by the addition of cation exchange resin and masses are determined by MALDI-TOF MS. The mass fingerprint is used to identify deviations from the reference sequence. Gas phase fragmentations of the RNA/DNA chimera were also studied. With the high throughput capability of MALDI-TOF MS, this facile method is well suited for screening DNA sequences of limited genomic regions of interest in a large number of individuals. This rapid and accurate, new method, has many potential applications including: DNA genotyping, DNA multiplex allele-specific genotyping, DNA micro-haplotyping, DNA methylation analysis and DNA sequencing
Depuis le séquençage complet du génome humain, la génomique se focalise sur la détection des modifications de l'ADN des gènes potentiellement impliqués dans les maladies humaines. Les modifications de l'ADN sont au niveau de la séquence ou épigénétique. Ces polymorphismes, fréquents, rares, connus ou inconnus, peuvent être identifiés par le développement de nouvelles méthodes de séquençage de l'ADN pour chaque individu. Ce projet a pour but le développement de méthodes d'analyse de l'ADN par clivage d'une chimère ARN/ADN et par MALDI-TOF MS. Elle repose sur l'utilisation d'une nouvelle classe d'ADN polymérases qui peut incorporer également des ribonucléotides. La chimère ARN/ADN, simple ou double brin, contient trois bases désoxynucléotides et une quatrième base sous sa forme ribonucléotide. Elle est ensuite clivée après chaque ribonucléotide par l'hydroxyde de sodium. Les fragments de clivage se terminent par un ribonucléotide qui possède un groupement 3'- phosphate terminal. Ils sont dessalés par des billes échangeuses de cation et leurs masses sont analysées par MALDI-TOF MS. La comparaison des masses de l'individu avec celles de la séquence de référence est significative d'un changement dans la séquence d'ADN. Les fragmentations en phase gazeuse de la chimère d'ARN/ADN ont également été étudiées. Cette méthode est adaptée pour l'étude d'un grand nombre d'individus dans une région limitée du génome grâce à la capacité haut-débit du MALDI-TOF MS. Cette méthode, rapide et efficace, possède de nombreuses applications tel que: le génotypage, le génotypage allèle-spécifique en multiplex, le microhaplotypage en multiplex, l'analyse de la méthylation de l'ADN et le séquençage
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