Interactomics of key kinases in energy metabolism : Characterizing interactions of AMP-activated protein kinase & B-type creatine kinase
Ineractomique d'enzymes clef du métabolisme énergétique : Charactérisation d'interactions de la protéine kinase activée par AMP et de la creatine kinase cytosolique du cerveau (B-type)
Résumé
A key property of complex biological systems is the presence of interaction networks crucial for all levels of cellular function, including the regulation of cellular energy. Two enzymes take center stage in the regulation of cellular and whole body energy metabolism. Creatine kinase (CK) functions as an intracellular energy storage and transport system playing a crucial role in the acute response to increasing energy demands. AMP-activated protein kinase (AMPK) regulates cellular and whole body energy delivery and consumption. We first applied an original cytosolic Y2H screen to identify new protein-protein interactions of cytosolic brain type CK (BCK) and AMPK in human brain. Various interaction candidates were identified, among them vesicle associated membrane proteins (VAMPs) interacting with both kinases. AMPK-VAMP interaction was confirmed by co-immunoprecipitation from synaptic vesicles, but did not lead to VAMP phosphorylation, suggesting that VAMP rather recruits AMPK for a regulation of exo- and endocytotic processes. A second strategy combining a biophysical interaction screen (Surface Plasmon Resonance, SPR) with an in vitro phosphorylation assay revealed rather AMPK isoform-specific targets. One is fumarate hydratase, which is preferentially phosphorylated by AMPK221, leading to an increase in enzyme activity in vitro. Finally, one class of interaction candidates, the glutathione S-transferases GSTM1 and -P1, were characterized in detail by a panel of interactomics methods (Y2H, SPR, co-immunoprecipitation) as reliable, high affinity interactors and identified as new AMPK substrates. In case of GSTP1, this leads to an increase in its enzymatic activity, suggesting a direct role of AMPK signaling in oxidative stress defense.
Une propriété clé des systèmes biologiques est la présence d'un réseau d'interactions protéiques, crucial pour toute fonction cellulaire comme par exemple la régulation du métabolisme énergétique. Deux enzymes clé impliquées dans cette régulation sont la créatine kinase (CK), dont la fonction consiste dans la gestion du stock et du transfert d'énergie, et la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK), qui régule l'homéostasie énergétique au sein de la cellule et de l'organisme entier. Dans un premier temps un crible de double hybride en levure original fut appliquée afin d'identifier de nouveaux partenaires d'interaction de la CK cytosolique du cerveau (BCK) et de l'AMPK dans le cerveau humain. Différents candidats d'interaction furent identifiés, dont des protéines membranaires associées aux vésicules (VAMP) interagissant avec les deux kinases. L'interaction AMPK-VAMP fut confirmée par co-immunoprecipitation à partir de vésicules synaptiques, mais ne menait pas à la phosphorylation de VAMP, suggérant que VAMP recrute AMPK pour la régulation de processus d'endo- et d'exocytose. Une seconde stratégie combinant un essai d'interactions biophysique, basé sur la résonance plasmonique de surface (SPR), avec des essais de phosphorylation in vitro permit la sélection de cibles AMPK isoforme spécifique. Une de ces cibles fut la fumarate hydratase, dont la phosphorylation préférentielle par l'AMPK221 provoque une augmentation de l'efficacité enzymatique in vitro. Finalement, une classe de candidats d'interaction, les glutathion S-transferases GSTM1 et -P1, fut caractérisée en détail par un panel de méthodes d'interactomique (SPR, double hybride, co-immunoprécipitation). Cette étude les identifie comme interacteurs fiables à haute affinité ainsi que nouveaux substrats de l'AMPK. Dans le cas de GSTP1 la phosphorylation par AMPK provoque une augmentation de son activité enzymatique suggérant un rôle direct de la signalisation par AMPK dans la défense contre le stress oxydatif.