Imagerie 3D résolue en temps pour l'aide au diagnostic médical : développement d'un système de microscopie de fluorescence multipoints sous excitation à deux photons.
Résumé
Confocal and two-photon microscopies are key methods for biomedical research and cells or tissue imaging. However, one of the main drawbacks of the conventional two-photon microscope is the imaging speed. Consequently, the first aim of this work was to speed up acquisition in order to preserve samples from too long experiments. In this context, we have developed an original set-up called multifocal multiphoton microscope composed of an optical system creating an 8×8 beam array. The second aspect of this work was to develop new methods of medical diagnosis. An early diagnosis of malignant tumors is essential to increase the therapy success and the patient's survival. But, the current standard to diagnose the presence of tumoral cells is of limited value because of its low sensitivity especially to atypical cells. Thus, the enhancement of early cancer diagnosis and treatment has involved the development of new methods to identify cancer signatures. For that purpose, we have an interest in fluorescence imaging methods for ex vivo diagnosis of cervix cancers. We then applied the same approach to detect possible resistance to drugs currently used in bladder chemotherapy. At the present time, patients attacked by a bladder cancer can be efficiently treated with combined chemotherapy such as M-VAC, but drug resistance may appear. In order to detect possible resistance to M-VAC, we have developed an ex vivo method from urinary samples, based upon the visible excitation of the drug fluorescence. Such pre-treatment step which does not exist at the present time will constitute a reliable, non constraining and inexpensive test enabling us to assess chemotherapy effectiveness.
L'utilisation de la microscopie confocale et biphotonique de fluorescence est de plus en plus répandue dans le domaine biomédical. En effet, l'imagerie d'intensité, de spectre et de durée de vie de fluorescence permettent de détecter, quantifier et imager les composants fluorescents intrinsèques d'un milieu biologique ainsi que les sondes extrinsèques. Dans le cadre du dépistage précoce de cancer, les modes de détection non-invasifs actuellement mis en place manquent de sensibilité pour permettre d'établir de manière fiable un diagnostic. Les médecins ont alors recours à des examens complémentaires, invasifs, comme la biopsie. Dans le cas de notre étude, différentes techniques de microscopie ont été exploitées pour mettre en place une méthode de diagnostic précoce non-invasive de cancer. Nous avons ainsi utilisé conjointement la microscopie confocale résolue spectralement et la microscopie biphotonique pour les images de durée de vie de fluorescence (FLIM). Cette dernière technique a d'ailleurs été récemment optimisée avec la mise en place d'un système d'excitation biphotonique multipoint qui permet d'accélérer significativement la vitesse d'acquisition des images. Il s'agit d'un système optique générant une matrice de 64 faisceaux excitateurs ce qui réduit considérablement le temps d'exposition des échantillons biologiques, les préservant ainsi des photodégradations. Ces techniques, largement complémentaires, ont permis de différencier, sur différents types de cytologies, les cellules présentant une faible malignité des cellules saines en utilisant comme facteur de contraste la fluorescence des entités intracellulaires. Grâce à cette méthode, les cellules de bas grades de malignité ont pu ainsi être identifiées sur des cytologies du col de l'utérus. En s'appuyant sur une démarche expérimentale similaire, un nouveau test a également été élaboré permettant de déceler avant traitement chez un patient une résitance à des polychimiothérapies usuellement utilisées dans le traitement des cancers urothéliaux tel que M-VAC. A l'issu de ce travail, une signature spectroscopique permettant de discriminer les cellules résistantes des cellules sensibles à la polychimiothérapie a pu être identifiée.
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