Contribution of DNA polymerase eta in the DNA damage response in cells deficient in nucleotide excision repair
Implication de l'ADN polymérase eta dans la réponse aux dommages de l'ADN dans des cellules déficientes en réparation par excision de nucléotides
Résumé
DNA damages interfere with replication and transcription. They are normally eliminated by repair mechanisms, such as nucleotide excision repair (NER). They can also be tolerated by translesion DNA synthesis (TLS). During my PhD work, we studied the involvement of NER pathway and DNA polymerase η (Polη) associated with TLS in response to DNA damages induced by ultraviolet (UV) and a chemotherapeutic drug, doxorubicin.The main lesions induced by UV irradiation are cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) and pyrimidine (6-4) pyrimidones (6-4PPs) which are removed by NER. Data on the formation of single-stranded DNA regions and those of the cell cycle suggest that 6-4PPs lesions are tolerated by a post-replication repair mechanism in XP-C cells (xeroderma pigmentosum group C, deficient in NER). In a second time, my goal was to determine the contribution of Polη in the tolerance of lesions induced by UV in XP-C cells. Indeed, it is known that Polη is responsible for the replication of CPDs, but in the absence of Polη, NER-proficient cells are not hypersensitive to UV rays. In addition, it was suggested that Polη is also involved in the TLS of 6-4PPs. By knocking down (KD) the expression of the gene encoding Polη in XP-C cells with a shRNA, we established the first stable line of human fibroblasts deficient in both NER and Polη (XP-C/PolηKD). This functional reduction in the expression of Polη in XP-C cells irradiated with low UVC dose resulted in an irreversible cell cycle arrest, the generation of single- and double-strand DNA breaks and significant cell death. These data demonstrate a crucial role for Polη in the survival of NER-deficient cells after UV irradiation and suggest that Polη can also participate in the TLS of 6-4PPs.In addition, we showed that cells deficient in NER or Polη are sensitized by treatment with doxorubicin indicating that NER and Polη also participate in the response of DNA damages induced by this agent.In conclusion, during my PhD work, we highlighted the complex interconnections between Polη and NER pathway in response to different genotoxic agents.
Les dommages de l’ADN interfèrent avec sa réplication et sa transcription. Ils sont en général éliminés par des mécanismes de réparation, en particulier par la réparation par excision de nucléotides (NER). Ils peuvent également être tolérés grâce à la synthèse translésionnelle (TLS). Au cours de mon travail de thèse, nous avons étudié l’implication de la voie NER et de l’ADN polymérase η (Polη) associée à la TLS dans la réponse aux lésions de l’ADN induites par les rayons ultraviolet (UV) et par une drogue chimiothérapeutique, la doxorubicine. Les principales lésions induites par les rayons UV sont les dimères de pyrimidine cyclobutane (CPDs) et les pyrimidines (6-4) pyrimidones (6-4PPs) qui sont éliminées par la NER. Les données obtenues sur la formation de régions d’ADN simple brin et celles du cycle cellulaire suggèrent que les lésions 6-4PPs sont tolérées par un mécanisme de réparation post-réplicative dans des cellules XP-C déficientes en NER (xeroderma pigmentosum du groupe C). Dans un second temps, mon objectif a été de déterminer la contribution de Polη dans la prise en charge des lésions induites par les rayons UV dans les cellules XP-C. En effet, il est connu que Polη est responsable de la réplication des CPDs, mais l’absence de Polη dans des cellules proficientes en NER ne les rend pas hypersensibles aux rayons UV. De plus, il a été suggéré que Polη soit impliquée dans la TLS des 6-4PPs. En réprimant par shARN l’expression du gène codant Polη dans les cellules XP-C, j’ai réussi à établir la première lignée stable de fibroblastes humains déficients à la fois en NER et en Polη (XP-C/PolηKD). Cette réduction fonctionnelle de l’expression de Polη dans les cellules XP-C irradiées à faible dose d’UV a entraîné un arrêt irréversible du cycle cellulaire, la génération de cassures simple- et double-brin de l’ADN et une mortalité cellulaire significative. Ces résultats montrent un rôle crucial de Polη dans la survie des cellules déficientes en NER après irradiation UV et suggèrent que Polη puisse participer aussi à la TLS des 6-4PPs.Par ailleurs, nous avons montré que les cellules déficientes en NER ou en Polη ont été sensibilisées par un traitement à la doxorubicine indiquant que la NER et Polη participent également de la prise en charge des lésions induites par cet agent. Donc au cours de mon travail de thèse, j’ai mis en évidence des interconnexions complexes entre Polη et la voie NER en réponses à différents agents génotoxiques.
Os danos do DNA interferem com a sua replicação e transcrição. Eles são normalmente removidos por mecanismos de reparo, como o reparo por excisão de nucleotídeos (NER). Lesões não removidas também podem ser toleradas por processos específicos de síntese de translesão (TLS). Durante este trabalho de tese, estudamos a implicação da via NER e da DNA polimerase η (Polη), associada à TLS, na resposta aos danos no DNA provocados pela irradiação ultravioleta (UV) e por um agente quimioterápico, a doxorrubicina.As principais lesões provocadas pela luz UV são os dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs) e as pirimidinas (6-4) pirimidonas (6-4PPs) que são removidas pelo NER. Os resultados obtidos sobre a formação de regiões de DNA simples fita e os dados de ciclo celular indicam que as lesões 6-4PPs são toleradas por un mecanismo de reparo pós-replicativo em células XP-C deficientes em NER (xeroderma pigmentosum do grupo C). Em seguida, buscamos determinar a contribuição da Polη na tolerância de lesões UV em células XP-C. De fato, é conhecido que a Polη é responsável pela replicação dos CPDs, porém a ausência dessa em células proficientes em NER não as torna hypersensíveis à irradiação UV. Além disso, foi sugerido que Polη poderia estar envolvida na TLS dos 6-4PPs. A expressão do gene POLH, que codifica Polη, foi silenciada através de shRNA em células XP-C, sendo assim estabelecida a primeira linhagem estável de fibroblastos humanos deficientes em ambas proteínas XPC e Polη. Essa redução funcional da expressão de Polη em células XP-C provocou, em células irradiadas com doses baixas de luz UV, uma parada irreversível no ciclo celular, a formação de quebras no DNA (incluindo quebras simples e dupla fita) e morte celular. Esses resultados revelam um papel crucial da Polη na sobrevida das células deficientes em NER após irradiação UV e sugerem que Polη possa também participar da TLS de lesões tipo 6-4PP.Por outro lado, participei de trabalho no qual demonstramos que células deficientes em NER ou em Polη são sensibilizadas pelo tratamento com doxorrubicina, o que indica que o NER e a Polη participam da resposta aos danos induzidos por esse agente.Em conclusão, ao longo do meu trabalho de tese, eu coloquei em evidência interconexões complexas entre a Polη e o NER em resposta a diferentes agentes genotóxicos.
Domaines
Cancer
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