Development of second generation sequencing technologies for the analysis of DNA methylation signatures
Développement de méthodes de séquençage de seconde génération pour l'analyse des profils de méthylation de l'ADN
Résumé
The analysis of DNA methylation patterns has become of great interest as methylome alterations have been found in many diseases. MeDIP (Methylated DNA ImmunoPrecipitation) immunoprecipitates genome-wide methylated sequences many of which are located in the repetitive sequences. Such sequences are difficult to align unambiguously after sequencing (MeDIP-Seq) leading to a large number of sequences that are currently not used for further analysis. We present an innovative method called MeDIP-dep-Seq which depletes a significant part of several classes of these highly repetitive sequences (up to 300-fold decrease), while unique sequences of interest are not affected. After sequencing on a second generation sequencer (GAIIx, Illumina) the alignment rate substantially enhanced increasing thus the amount of usable sequences. We have further developed a pipeline for the analysi of MeDIP-Seq datasets. Potential candidate regions identified in this genome-wide assay can then be validated by the use of selector probes that specifically capture genomic regions of interest. We introduced a bisulfite treatment in the selection protocol and developed a novel multiplex assay. 98 gene loci were enriched in 6 samples and were then sequenced in parallel on a bench sequencer (GS Junior, Roche). The combination of these technologies will permit the establishment of methylome maps and the identification of novel epigenetic biomarkers for cancer and complex diseases diagnostics and prognosis.
L'analyse des profils de méthylation présente un grand intérêt car des altérations du méthylome sont impliquées dans de nombreuses pathologies. Le MeDIP (Methylated DNA ImmunoPrecipitation) immunoprécipite les séquences méthylées sur le génome entier, la plupart étant localisées dans les séquences répétées. De telles séquences sont difficiles à aligner après séquençage (MeDIP-Seq) et bon nombre d'entre elles ne peuvent donc être utilisées pour la suite des analyses. Nous présentons une méthode innovante appelée MeDIP-dep-Seq permettant de supprimer une quantité significative de plusieurs familles de ces éléments répétés (diminution d'un facteur de 300 au maximum) tandis que les séquences uniques d'intérêt ne sont pas affectées. Après séquençage sur un séquenceur de seconde génération (GAIIx, Illumina), le taux d'alignement est amélioré de façon conséquente permettant ainsi d'augmenter la quantité de séquences analysables. Nous avons également développé une plateforme d'analyse des données issues du MeDIP-Seq. De potentielles régions candidates identifiées par cette technique sur le génome entier peuvent ensuite être validées en utilisant des sélectors, sondes permettant la capture de régions génomiques d'intérêt. Nous avons introduit un traitement au bisulphite dans le protocole de sélection afin de développer un nouvel outil pour une analyse multiplexe. 98 loci ont été enrichis dans 6 échantillons puis séquencés en parallèle sur un séquenceur de paillasse (GS Junior, Roche). La combinaison de ces technologies permettra d'établir des cartes du méthylome et d'identifier des nouveaux biomarqueurs épigénétiques pour diagnostiquer et pronostiquer les cancers et maladies complexes.
Loading...