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Fiche détaillée Thèses
Université Joseph-Fourier - Grenoble I (18/12/2007), Thierry Livache (Dir.)
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Détections d'interactions biologiques par imagerie de résonance plasmonique de surface : applications au criblage pharmaceutique de chimiothèques & à la détection de toxines
Sébastien Laurent1

Le développement important des biocapteurs pour des applications médicales entraînent, depuis ces dernières années, à envisager d'autres façons de construire des plans d'expérience. Ainsi, les travaux ici présentés tentent de répondre à une problématique originale consistant à détecter des événements ayant une faible probabilité de se produire selon deux approches "antagonistes" ; d'une part, le criblage pharmaceutique de molécules chimiques et d'autre part, la détection de toxines à usage bioterroriste. Alternativement, ce sont les sondes et les cibles qui présentent une activité inconnue vis-à-vis de leur partenaire. Pour y répondre, nous avons envisagé la combinaison de la technique d'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi) et l'utilisation de biopuces. L'immobilisation de composés chimiques issus de la chimie combinatoire est effectuée selon une conception préalable des molécules afin qu'elles soient compatibles en vue d'une immobilisation dans un polymère fin de polypyrrole. Appliquée à la recherche de nouvelles molécules interagissant avec l'ARN polymérase bactérienne, enzyme cible pour l'élaboration de molécules à activité antibiotique, ce procédé a permis d'isoler plusieurs molécules appartenant à la famille des hydantoïnes et des quinazoline-2,4-diones capables de réagir avec la cible pharmacologique choisie. Une miniaturisation des procédés de fabrication ouvre la voie vers une augmentation des débits de criblage de ce type de méthode. Dans le cadre de la détection de toxines, la chaîne B de la ricine a été prise pour modèle d'étude. Afin de surmonter les limitations de la technique par SPRi, un protocole d'amplification du signal a été mis au point. Celui-ci a permis de déceler jusqu'à 10 pM en analyte, c'est-à-dire une sensibilité comparable aux autres méthodes de transduction. Grâce à cette stratégie analytique multi-étape, une gamme dynamique de 3 ordres de grandeur a été établie. Une extension de cette approche analytique pourra à court terme amener à doser simultanément plusieurs toxines.
1 :  SPRAM - UMR 5819 - Structures et propriétés d'architectures moléculaire
imagerie SPR – chimie combinatoire – biopuces à petits ligands – immunocapteur à toxine – polypyrrole – nanoparticules

Detections of biological interactions by surface plasmon resonance imaging: applications to pharmaceutical screening of chemical libraries & to detection of toxins
The significant development of biosensors for medical applications result, in recent years, to consider other ways of constructing experimental designs. Thus, the work presented here try to respond to original problem of detecting events with low probability of occurring following two approaches "antagonists", on the one hand, pharmaceutical screening of chemical molecules and secondly, the detection of toxins for bioterrorist use. Alternatively, the probes and targets have unknown activity toward their partner. To answer this, we considered the combination of the imaging technique of surface plasmon resonance (SPRi) and the use of microarrays. Immobilization of chemical compounds from combinatorial chemistry is performed according to a prior design of molecules so that they are compatible to a standstill on a polymer end of polypyrrole. Applied to the search for new molecules that interact with bacterial RNA polymerase, an enzyme target for the development of molecules with antibiotic activity, this process has allowed the isolation of several molecules belonging to the family of hydantoins and quinazoline-2, 4-diones capable of reacting with the pharmacological target selected. Miniaturization of manufacturing processes opens the way to increased rates of this type of screening method. In the context of the detection of toxins, ricin B chain has been taken as a model study. To overcome the limitations of the technique SPRi a signal amplification protocol was developed. This has revealed down to 10 pM of analyte, that is to say, a similar sensitivity to other methods of transduction. With this multi-step analytical strategy, a dynamic range of 3 orders of magnitude has been established. An extension of this analytical approach may lead to short-term simultaneous determination of several toxins.
SPR imaging – combinatorial chemistry – small ligand biochips – toxin immunosensor – polypyrrole – nanoparticles

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