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Fiche détaillée Thèses
Université Paul Cézanne - Aix-Marseille III (02/12/2012), Anne Sentenac (Dir.)
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ANNEX
PhD_defense-J.Girardv3.1.pptx(10.4 MB)
Microscopies de fluorescence et de diffraction super-résolues par éclairement multiple
Jules Girard1

Ce travail de thèse concerne l'amélioration du pouvoir de résolution de la microscopie optique en champ lointain. Nous avons étudié et développé des techniques permettant de dépasser la limite fondamentale de résolution établie par Abbe en 1873. Toutes tirent profit de la relation liant le champ électromagnétique émis ou diffracté par un objet à l'éclairement employé pour l'observer. En enregistrant plusieurs images du même objet sous différents éclairements, puis en utilisant un algorithme d'inversion approprié, il est possible d'avoir accès à certaines fréquences spatiales de l'objet qui sont habituellement filtrées par le microscope. Ce concept est d'abord appliqué à une technique de microscopie cohérente ne nécessitant pas le marquage de l'échantillon : la microscopie tomographique de diffraction. Cette méthode permet de reconstruire numériquement des cartes quantitatives de la permittivité diélectrique de l'objet avec une résolution significativement meilleure que celle d'un microscope large-champ classique à partir de plusieurs hologrammes de l'échantillon obtenus sous diverses incidences. Nous montrons théoriquement et expérimentalement que, loin d'être un désavantage, le phénomène de diffusion multiple permet, s'il est correctement pris en compte, d'atteindre des résolutions encore plus spectaculaires. Nous étudions ensuite, avec des outils conceptuellement proches, la microscopie de fluorescence par éclairement structuré. Nous avons proposé deux approches différentes pour améliorer cette technique de microscopie. La première tire profit du développement d'un algorithme d'inversion capable de retrouver la densité de fluorescence de l'objet sans connaitre les éclairements utilisés a priori. Grâce à cet algorithme, nous pouvons remplacer le motif d'illumination habituellement périodique et contrôlé de la microscopie à éclairement structuré classique par des speckles aléatoires obtenus en bougeant un diffuseur à travers un faisceau laser. Des résultats expérimentaux très encourageants montrent l'efficacité de cette approche dont la mise en œuvre expérimentale est remarquablement simple. La seconde consiste à remplacer la lamelle de verre sur laquelle est déposé l'échantillon par une lamelle périodiquement nanostructurée. Celle-ci crée à sa surface une grille de lumière de période bien inférieure à la limite imposée par la diffraction, et qui peut être utilisée pour sonder les fréquences spatiales les plus élevées de l'échantillon. Nous détaillons la conception, la fabrication et la caractérisation expérimentale de ce substrat nanostructuré.
1 :  IF - Institut FRESNEL
SEMO
Microscopie Optique – Super-resolution – Resolution – Fluorescence – Réseau résonnant – Speckle – Tomographie Optique de Diffraction – Éclairement strucure

Super-resolution in Fluorescence and Diffraction Microscopies by multiple illuminations
This PhD work focuses on the resolution improvement of far-field optical microscopy. We have studied and developed different techniques that take advantage of the relationship between the sample, the illumination and the diffracted (or emitted) field, in order to increase the final band-pass of the image beyond that imposed by the diffraction phenomenon. In In these approaches, several images of the same sample are recorded under different illuminations. An inversion algorithm in then used to reconstruct a super-resolved map of the sample from the set of measurements. This concept is first applied to coherent microscopy. In tomographic diffraction microscopy, many holograms of the same unstained sample are obtained under various incidences and the quantitative map of permittivity of the sample is reconstructed numerically from the set of data. The resolution is usually better than that of classical wide-field microscopy. We show theoretically and experimentally that, far from being a drawback, the presence of multiple scattering within the sample can, if properly accounted for, lead a to an even better resolution. We then study structured illumination fluorescence microscopy. We present two different ways for improving this method. The first one takes advantage of an inversion algorithm, which is able to retrieve the fluorescence density without knowing the illumination patterns. This algorithm permits one to replace the periodic light pattern classically used in structured illumination microscopy by unknown random speckle patterns. The implementation of the technique is thus considerably simplified while the resolution improvement remains. In the second approach, we propose to replace the coverslip on which the sample usually lays, by a sub-lambda grating. The latter is used to form, in near field, a light grid with sub-diffraction period that is able to probe the finest details of the sample. The design, fabrication and optical characterization of this key structure are detailed.
Optical Microscopy – Super-Resolution – Resolution – Fluorescence – Resonant Grating – Speckle – Optical Diffraction Tomography – Structured Illumination

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