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Fiche détaillée Thèses
Université Paris Sud - Paris XI (30/09/2011), Joelle Marie (Dir.)
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VA2_LAURENT_FRANCOIS-XAVIER_30092011.pdf(22.2 MB)
Une nouvelle fonction pour la DEAD-box ARN hélicase p68/DDX5 dans la Dystrophie Myotonique de type 1
François-Xavier Laurent1

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est cause par l'expansion anormale d'un triplet CTG dans la partie 3'UTR du gène DMPK, entrainant l'agrégation du transcrit mutant dans des inclusions ribonucléoprotéiques appelées foci. D'après plusieurs études structurales sur des courtes répétitions CUG, il a été proposé que les expansions CUG se replient en une structure en tige-boucle qui interfère avec l'activité de plusieurs facteurs lié au métabolisme de l'ARN et altère leur fonction cellulaire. Le facteur d'épissage muscleblind-like 1 (MBNL1) a été identifié par sa capacité à interagir avec les répétitions CUG. In vivo, ces répétitions entrainent la séquestration de cette protéine aboutissant en une déplétion nucléaire. Un autre facteur d'épissage, la CUG Binding protein (CUGBP1), est également impliqué dans la pathologie. Au lieu d'être séquestré par les répétitions, la stabilité protéique de CUGBP1 est augmentée dans les tissus DM1 entrainant un gain d'activité pour ce facteur. La séquestration de MBNL1 et la stabilisation de CUGBP1 résultent en la dérégulation de l'épissage alternatif de plusieurs transcrits musculaires et du cerveau et la réexpression d'isoformes protéiques fœtales dans les tissus adultes. Cependant, de récentes études suggèrent que d'autres facteurs ou voies de signalisation que celles faisant intervenir MBNL1 et CUGBP1 pourraient être impliquées dans la pathologie DM1.Le but de mon travail de thèse a été d'identifier de nouveaux facteurs ayant la capacité d'interagir avec les répétitions CUG. A l'aide d'une purification sur chromatographie d'affinité utilisant un ARN contenant 95 répétitions CUG comme appât, nous avons identifié l'ARN hélicase p68/DDX5. p68 fait partie de la famille des protéines DEAD-box, caractérisée par un core protéique conservé constitué de neufs domaines hautement conservés, dont le motif DEAD, à l'origine du nom de ces protéines. p68 est impliquée dans de nombreux aspects du métabolisme de l'ARN, dont la transcription, l'épissage, l'export, la traduction et la dégradation des ARN. Nous avons montré, que p68 colocalise avec les foci CUG dans un modèle cellulaire exprimant la partie 3'UTR du gène DMPK contenant de longues répétitions CTG. Nous avons identifié que p68 augmente l'interaction de MBNL1 sur les répétitions CUG et une structure secondaire particulière d'un élément régulateur de l'ARN pré-messager cardiac Troponin T (TNNT2), dont l'épissage est dérégulé dans la pathologie. L'insertion de mutations dans le core de l'hélicase de p68 abolit l'effet de p68 sur la fixation de MBNL1 ainsi que la colocalisation de p68 avec les expansions CUG in vivo, suggérant que le remodelage des structures secondaires ARN de manière ATP-dépendante par p68 facilite l'interaction de MBNL1. Nous trouvons également que la compétence de p68 pour réguler l'inclusion de l'exon alternatif 5 de TNNT2 dépend de l'intégrité des sites de fixation de MBNL1.Nous proposons que p68 agit comme un modificateur de l'activité de MBNL1 sur ces cibles d'épissage ainsi que sur les expansions CUG à l'origine de la pathologie.
1 :  CGM - Centre de génétique moléculaire
Epissage alternatif – Dystrophie myotonique – Dead Box

A new function for the DEAD-box RNA helicase p68/DDX5 in Myotonic Dystrophy type 1
Myotonic Dystrophy type I (DM1) is caused by an abnormal expansion of CTG triplets in the 3' UTR of the DMPK gene, leading to the aggregation of the mutant transcript in nuclear RNA foci. Based on structural studies on short CUG repeats, it has been proposed that expanded CUG repeats fold into an imperfect hairpin structure that interferes with the activities of RNA binding proteins and alters their normal cellular function. The muscleblind-like 1 protein (MBNL1) was identified by its ability to bind to CUG repeats. It has been shown that the expanded mutant transcript promotes the sequestration of the MBNL1 splicing factor in nuclear RNA foci. CUGBP1 is another splicing factor that is involved in DM1. Instead of being sequestered by the repeats, the steady-state level of CUGBP1 is increased in DM1 tissues, leading to a gain of activity of the protein. The sequestration of MBNL1 and the up-regulation of CUGBP1 in DM1 results in the misregulation of alternative splicing of a subset of muscle and brain-specific transcripts, leading to the re-expression of fetal isoforms in adult tissues. However, several recent studies suggest that factors or signaling pathways other than MBNL1 and CUGBP1 could be involved in DM1 pathogenesis.The aim of this work was to isolate new factors that bind to CUG repeats. Using an affinity chromatography strategy with an RNA containing 95 pure CUG repeats, we identified the RNA helicase p68 (DDX5). p68 is a prototype of DEAD-box RNA helicase proteins. This family is characterized by a conserved core, consisting of nine conserved motifs including the DEAD signature, which gives rise to the name to these proteins. p68 is involved in many aspects of RNA metabolism including transcription, RNA processing, RNA export, translation and mRNA degradation. We showed that p68 colocalized with RNA foci in cells expressing the 3'UTR of the DMPK gene containing expanded CTG repeats. We found that p68 increased MBNL1 binding onto pathological repeats and the stem-loop structure regulatory element within the cardiac Troponin T (TNNT2) pre-mRNA, splicing of which is misregulated in DM1. Mutations in the helicase core of p68 prevented both the stimulatory effect of the protein on MBNL1 binding and the colocalization of p68 with CUG repeats, suggesting that remodeling of RNA secondary structure through a ATP-dependant manner by p68 facilitates MBNL1 binding. We also found that the competence of p68 for regulating TNNT2 exon 5 inclusion depended on the integrity of MBNL1 binding sites.We propose that p68 acts as a modifier of MBNL1 activity on splicing targets and pathogenic RNA.
Alternative splicing – Myotonic Dystrophy – Dead Box

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