From the understanding of cancer initiating cell behavior in glioblastomas to the development of a suitable nanomedicine. Focus on the cancer stem cell marker AC133/CD133
De la compréhension du comportement des cellules initiatrices de cancer dans les glioblastomes au développement d'une nanomédecine adaptée. Focalisation sur le marqueur de cellules souches cancéreuses AC133 / CD133
Résumé
The discovery of cancer initiating cells in glioblastomas and the existence of cancer stem cells (CSCs) suggest that failure of current anti-tumor strategies could be attributed to a problem of target cell. In the context of targeted therapies, the emergence of nanomedicines offer new perspectives for drug delivery to CSCs or their microenvironment (or niche) thus getting more efficacy, specificity and biological safeness. Capable to self-renew and to generate radio and chemo-resistant neoplastic clones, CSCs do not have, however, specific markers but instead associated markers allowing their enrichment and potentially their targeting notably for loco-regional therapies. By focusing on the AC133 epitope, that is a CSC marker associated to glycosylation on the protein CD133 or prominin-1, the aim of this PhD thesis was to contribute understanding on: i) What the expression of AC133 is accounting for (tumor initiation, tumor aggressiveness or hypoxia) ii) If it is possible to recognize AC133 by nanocarriers iii) What is, regarding its distribution among membrane protrusions, the functional role of CD133/AC133. From in vitro and in vivo models of human glioblastomas implanted in the brain of immunodeprived mice (SCID), our data established that AC133 is a witness of non-chronic exposure to high oxygen tension (21% O2 versus 3% O2). In this context, the shRNA knockdown strategy allowed demonstrating that HIF-1α regulates AC133 expression. The lack of AC133 expression at 21% O2 within non sorted glioma cell populations is not related to the tumor initiation but instead associated to a loss of tumor aggressiveness. The AC133 target was therefore chosen to develop lipid nanocapsules (LNCs), capable of recognizing CSCs. By mean of a bifunctionnal a polymer (DSPE-PEG2000-maleimide) and the monoclonal antibody AC133, a lipo-immunoglobulin (DSPE-PEG2000-maleimide-AC133) was synthesized and post-inserted within LNCs, thus allowing the obtention of immuno-LNCs. Those nano-objects demonstrated their functionalities by their specificity of binding to Caco-2 cells, which constitutively express AC133. Finally, by giving attention to the role of AC133/CD133 in endocytosis, we demonstrated by siRNA knockdown on Caco-2 cells that AC133/CD133 inhibits the cell internalization of transferrin and NCLs. Interestingly, increase of extracellular iron concentration, known to disminish the expression of the tranferrin receptor, equally regulated negatively those of AC133, thus supporting a role for AC133/CD133 in endocytosis and in iron metabolism. Taken together, those PhD data allowed to develop a new nano-tool and to better apprehend its usefulness for the application of naomedicines aiming to eradicate and/or to modify the behaviour of CSCs expressing AC133.
La mise en évidence de cellules initiatrices de cancer dans les glioblastomes et l'existence de cellules souches cancéreuses (CSCs) étayent la présomption que l'échec des stratégies anti-tumorales classiques puisse être attribué à un problème de cible cellulaire. Dans le contexte des thérapies ciblées, l'émergence des nanomédecines offre des perspectives pour la délivrance de principes actifs vers les CSCs ou leur microenvironnement (ou niche) en vue d'une meilleure efficacité, spécificité et sécurité biologique. Douées d'autorenouvellement et capables de générer des clones néoplasiques radio et chimiorésistants, les CSCs n'ont toutefois pas de marqueur exclusifs connus sinon des marqueurs associés permettant d'enrichir ces populations et de potentiellement établir un ciblage notamment locorégional au sein de ces tumeurs. En nous focalisant sur l'épitope AC133, marqueur de CSCs associé à des glycosylations de la protéine CD133 ou prominine-1, l'objectif de cette thèse a été: i) de comprendre la situation biologique traduite par l'expression d'AC133 (témoin d'initiation de tumeurs, d'agressivité tumorale ou d'hypoxie) ii) de développer une nanomédecine reconnaissant l'épitope AC133, iii) de déterminer, au regard de sa distribution au niveau de protrusions membranaires, le rôle fonctionnel de CD133/AC133. A partir de modèles in vitro et in vivo de glioblatomes humains implantés dans le cerveau de souris immunodéprimées (SCID), nos résultats établissent qu'AC133 est un témoin de non exposition chronique à une pression partielle élevée en oxygène (21% O2 versus 3% O2). Dans ce contexte la stratégie shRNA knockdown démontre que HIF-1α est un des régulateurs de l'expression d'AC133. L'absence d'AC133 à 21% O2 au sein de populations non triées de cellules de glioblastomes n'est pas reliée à l'initiation de tumeur mais en revanche associée à une perte d'agressivité tumorale. La cible AC133 a donc été choisie pour développer des nanocapsules lipidiques (NCLs) capables de reconnaitre des CSCs. A l'aide d'un polymère bifonctionnel, le DSPE-PEG2000-maleimide et de l'anticorps monoclonal AC133, une lipo-immunoglobuline (DSPE-PEG2000-maleimide- AC133), a été synthétisée puis post-insérée dans des NCLs permettant l'obtention d'immuno-NCLs. Ces nano-objets ont démontré leur fonctionnalité par leur spécificité de liaison à des cellules Caco-2 exprimant constitutivement AC133. Enfin, dans une dernière étude focalisée sur le rôle de AC133/CD133 dans l'endocytose, nous démontrons par siRNA knockdown sur des cellules Caco-2 que AC133/CD133 inhibe l'internalisation cellulaire de transferrine et de NCLs. De manière intéressante, l'augmentation de la concentration extracellulaire en fer, connue pour diminuer l'expression du récepteur de la transferrine, régule également négativement celle d'AC133, indiquant un rôle d'AC133/CD133 dans l'endocytose et dans le métaboslime du fer. L'ensemble de ce travail de thèse a donc permis de développer de nouveaux nano-outils et de mieux appréhender leur utilité pour l'application de nanomédicines visant à éliminer et/ou modifier leur comportement de CSCs AC133 positives.