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Fiche détaillée Thèses
Université Joseph-Fourier - Grenoble I (15/12/2009), Darren Hart (Dir.)
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Caractérisation Structurale des Kinase Humaines par le Criblage de Bibliothèque des Constructions
Hayretin Yumerefendi1

Le manque de protéine soluble est souvent un obstacle à la caractérisation structurale des protéines. Une approche courante pour surmonter cela consiste à isoler des domaines protéiques en utilisant des méthodes itératives de création et analyse de constructions. Autrement des banques d'ADN, contenant toutes les constructions possibles d'une même protéine, peuvent être crée par troncation enzymatique et testée à la fois pour l'expression et la solubilité de celle-ci. Dans ce projet, la nouvelle méthode d'Expression des Protéines Solubles par Troncation Aléatoire Incrémentielle (ESPRIT) a été utilisée pour explorer la définition des domaines protéiques. Des protéines kinases multidomaines qui avaient échoué surexpression solubles ont été choisies pour leur intérêt biologique. La méthode a d'abord été optimisée pour améliorer la qualité et l'efficacité des banques permettant un meilleur traitement de la diversité générée. Elle a ensuite été appliquée à une protéine kinase modèle DAPK1, à partir de laquelle une définition précise de domaine a été démontrée. Le criblage des constructions a ainsi permis l'identification de protéines plus stables, et cristallisation des constructions dans les conformations alternatives. La méthode a aussi été appliquée pour identifier des variants solubles du complexe DAPK1 et son partenaire la calmoduline, permettant de mettre en évidence un domaine d'interaction minimal, plus petit que celui décrit auparavant. Alors que plusieurs tentatives pour obtenir le domaine catalytique kinase de IKKb avaient échoué, des criblages additionnels sur cette protéine avec cette méthode ont permis d'identifier des domaines de régulation solubles et fonctionnels in vivo. Enfin, il a été démontré que des constructions du domaine catalytique de p110b, faiblement exprimées dans E.coli, pouvaient être exprimées solubles dans des cellules d'insectes avec des rendements plus importants.
1 :  EMBL - European Molecular Biology Laboratory
protein – kinase – evolution dirige – ESPRIT – biologie structural – solubilite – mTOR – DAPK1 – IKK2 – IKKb – PI3Kb – p110b – calmoduline – criblage de constructions – biotin – biotinylation

Structural Characterisation of Human Kinases using a Library-Based Construct Screening Approach
Structural characterization of proteins is often hindered by insufficient amounts of soluble protein. A common approach is to isolate its separate domains, classically done by time-consuming iterations of design, generation and testing of constructs. An alternative approach is to generate a random library of all possible constructs by enzymatic DNA truncation and test them in one experiment for expression and solubility. In this work, the novel, directed evolution-type method Expression of Soluble Proteins by Random Incremental Truncations (ESPRIT) was used to explore the definition of protein domains. The biological focus was a set of multidomain protein kinases that has previously resisted soluble over-expression and structural characterisation. First, improvements in the method were developed to improve the quality and efficiency of the truncation libraries leading to better coverage of the diversity. Then, its application on a more characterised protein, DAPK1, demonstrated precise domain definition. Small variations of the constructs resulted in significantly different thermal stability and crystal packing, thus providing a means to resolve structures with alternative conformations. The method was also used for the identification of soluble variants of the complex between DAPK1 and its partner calmodulin where the minimal interaction region was shorter than previously reported. The application of the method to a series of difficult-to-express protein kinases resulted in rapid identification of incompatibility with E. coli over-expression for some of the targets. While attempts to rescue the low solubility the IKKb kinase catalytic domain were unsuccessful, additional screens on this protein identified soluble and regulatory domains that showed some functionality in vivo. Finally, it was demonstrated that constructs of the PI3Kb p110b catalytic domain with residual solubility in E. coli, identified from screening, could be expressed in insect cells at higher yields in soluble form.
protein – kinases – directed evolution – ESPRIT – structural biology – solubility – mTOR – DAPK1 – IKK2 – IKKb – PI3Kb – p110b – calmoduline – construct screening – biotin – biotinylation – colony array

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